Purificazione delle proteine basata sulla cromatografia a scambio anionico: una tecnica di separazione per isolare una proteina di interesse dal lisato batterico dializzato basato sulla carica netta

Abstract

Fonte: Fuehner, S., et al. Purificazione della S100A12 umana e dei suoi oligomeri indotti da ioni per la stimolazione delle cellule immunitarie J. vis. (2019)

In questo video, dimostriamo una tecnica di cromatografia a scambio anionico per purificare le proteine leganti il calcio umano S100A12 basate sulla carica superficiale netta della proteina proveniente da una coltura di Escherichia coli.

Protocollo

1. Purificazione delle proteine

1. Cromatografia a scambio anionico
   1. dialisi
      1. Preparare il tampone A per cromatografia a scambio anionico (AIEX) sciogliendo 20 mM di Tris, 1 mM di EDTA e 1 mM di glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N, N, N', N'-acido tetraacetico (EGTA) in acqua deionizzata e regolare il pH a 8,5 con HCl. Per la dialisi preparare 2 x 5 L e per la cromatografia 2 x 1 L di tampone AIEX A.
         nota: Il volume del dialisato deve essere circa 100 volte il volume del campione. Tutti i tamponi utilizzati per la cromatografia devono essere filtrati (0,45 μm o più piccoli) e degassati (ad esempio, mediante bagno a ultrasuoni o degasaggio sotto vuoto).
      2. Tagliare il tubo per dialisi (cut-off del peso molecolare [MWCO]: 3,5 kDa) in una lunghezza appropriata con spazio aggiuntivo per l'aria per garantire la galleggiabilità del campione sopra la barra di agitazione rotante.
         nota: Il glicerolo preserva la membrana e deve essere rimosso prima dell'uso.
      3. Per ridurre la viscosità della soluzione proteica chiarita, diluire la soluzione con 25 mL di tampone AIEX A per facilitare la successiva applicazione alla colonna cromatografica. Fissare la prima chiusura sul tubo, caricare il campione nella membrana e fissare la seconda chiusura ad almeno 1 cm dall'estremità superiore del tubo.
      4. Posizionare il contenitore da 5 L con il tampone AIEX A su una piastra di agitazione, aggiungere una barra di agitazione e la membrana riempita con soluzione proteica. Regolare la velocità per ruotare il campione evitando interferenze con l'agitatore rotante. Dializzare per 12-24 ore a 4 °C, quindi sostituire il tampone dialisato (tampone AIEX A) con una nuova preparazione pre-raffreddata e continuare per almeno altre 4 ore. Trasferire la soluzione proteica dialitizzata in una provetta da 50 mL e filtrare attraverso un'unità filtrante da 0,45 μm.
         nota: Possibilità di stoccaggio.
   2. cromatografia
      1. Avviare il sistema di cromatografia liquida (FPLC) con la manutenzione generale, collegare i tamponi della colonna AIEX A e AIEX B (tampone AIEX A con 1 M di NaCl) e la colonna contenente la resina a scambio anionico. Fare riferimento alla Tabella 1 per i parametri cromatografici generali.
         nota: I tamponi, la colonna e l'apparecchiatura FPLC devono essere bilanciati alla stessa temperatura prima di iniziare la seduta (fare riferimento ai parametri cromatografici nella Tabella 1 e Tabella 2).
      2. Equilibrare la colonna con il tampone AIEX A, caricare successivamente il campione sulla colonna ed eluire le proteine con un gradiente lineare da 0% a 100% di tampone ad alto contenuto di sale (AIEX B). Fare riferimento alla Tabella 2 per un protocollo dettagliato del metodo.
      3. Raccogliere 2 mL di frazioni durante l'eluizione e analizzare 10 μL di ciascuna frazione su un'elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio al 15% colorata con Coomassie (SDS-PAGE). Raggruppare le frazioni contenenti S100A12 proteina per la dialisi.
         nota: Il peso molecolare di S100A12 è 10.575 Da.

Risultati

Tabella 1: Informazioni dettagliate sui parametri applicati della cromatografia a scambio anionico.

...

Volume del letto (CV)	75 ml
monitor	Assorbanza a 280 nM
Pressione max	3 bar
Buffer di colonna A	20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
25% HCl	Carl Roth	X897.1
4− 20% di gel proteici Mini-PROTEAN TGX	BioRad	4561093
Soluzione decolorante Coomassie Briliant Blue R250	BioRad	1610438
Soluzione colorante Coomassie Briliant Blue R250	BioRad	1610436
EDTA sale disodico diidrato	Carl Roth	8043.1
EGTA	Carl Roth	3054.3
Q Sepharose Fast Flow	GE Healthcare	17-0510-01	Resina per cromatografia a scambio anionico
Cloruro di sodio (NaCl)	Carl Roth	3957.2
Idrossido di sodio	Carl Roth	P031.1
Tris Base	Carl Roth	4855.3
0.45 µ m filtro siringa	Merck	SLHA033SS
5 L bicchiere di misura	Carl Roth	CKN3.1
50 mL provette coniche da centrifuga	Corning	430829
Chiusure dei tubi di dialisi	Spettro	132738
Frazione provette collettrici 5 mL	Greiner	115101
Membrana per dialisi Spectra/POR (3,5 kDa)	Spectrum	132724
Unità filtro Steritop	Merck	SCGPT01RE
Ä Purificatore KTA UPC 10	GE Healthcare		Sistema FPLC
Raccoglitore di frazioni	GE Healthcare	Frac-920
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658000EDU
NanoPhotometer	Implen	P330
pH	Soprammobile	765