Cromatografia di interazione idrofobica calcio-dipendente: una tecnica per purificare le proteine leganti il calcio basata su interazioni idrofobiche

Abstract

Fonte: Fuehner, S., et al., Purificazione della S100A12 umana e dei suoi oligomeri indotti da ioni per la stimolazione delle cellule immunitarie. J. Vis. Exp. (2019).

In questo video, dimostriamo la purificazione della proteina legante il calcio da un lisato cellulare dializzato attraverso la cromatografia di interazione idrofobica calcio-dipendente. Le proteine leganti il calcio espongono una regione idrofobica dopo il legame con il calcio, facilitando l'interazione con un gruppo idrofobico sulla resina. Successivamente queste proteine vengono eluite utilizzando il chelante del calcio EDTA che inverte l'interazione.

Protocollo

1. Cromatografia a interazione idrofobica calcio-dipendente (HIC)

1. dialisi
   1. Dializzare la soluzione proteica contro 20 mM di Tris, 140 mM di NaCl, pH 7,5
2. cromatografia
   1. Preparare 1 litro di tampone per cromatografia HIC A sciogliendo 20 mM di Tris, 140 mM di NaCl e 25 mM di CaCl2 in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,5. Per il tampone HIC B, sciogliere 20 mM di Tris, 140 mM di NaCl e 50 mM di EDTA. Regolare il pH a 7,0 e filtrare e degassare i tamponi. Aggiungere CaCl2 al campione fino a una concentrazione finale di 25 mM e filtrare attraverso 0,45 μm. Equilibrare i tamponi HIC e il campione a 4 °C (temperatura della colonna).
   2. Avviare il sistema di cromatografia liquida con la manutenzione generale, collegare i tamponi della colonna HIC A e B e la colonna. Fare riferimento alla Tabella 1 per ulteriori parametri cromatografici.
   3. Equilibrare la colonna, caricare il campione ed estendere il blocco "wash unbound sample" fino a quando il segnale UV non raggiunge nuovamente il livello di base. Quindi iniziare l'eluizione con un chelante del calcio contenente tampone (EDTA). Fare riferimento alla Tabella 2 per un metodo dettagliato protocol.
      nota: Esperimenti precedenti hanno dimostrato che un eccesso di calcio sembra essere benefico per il legame del S100A12 alla resina cromatografica.
   4. Raccogliere frazioni di picco di 2 mL e analizzare 10 μL di ciascuna frazione su una SDS-PAGE al 15% colorata con Coomassie. Raggruppare frazioni di S100A12 pure e dializzare contro soluzione salina tamponata con Hepes (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0).
      nota: Il coefficiente di estinzione del S100A12 monomerico è 2980 M-1 cm-1.

Risultati

Tabella 1: Informazioni dettagliate sui parametri applicati della cromatografia a interazione idrofobica.

blocco	volume	buffer	negozio
equilibrio	1-2 volumi di colonna (CV)	un	spreco
Carico del cam...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
chimico
EDTA sale disodico diidrato	Carl Roth	8043.1
Fenil Sefarosio ad alte prestazioni	GE Sanità	Codice 17-1082-01	Resina per cromatografia di interazione idrofobica
Cloruro di sodio (NaCl)	Carl Roth	Codice 3957.2
idrossido di sodio	Carl Roth	P031.1
Tris Base	Carl Roth	4855.3
25% HCl	Carl Roth	X897.1
Diidratto di cloruro di calcio	Carl Roth	Codice 5239.1
Articoli da laboratorio
Filtro per siringa da 0,45 μm	Merck	SLHA033SS
Provette a fondo tondo da 14 mL	Bd	352059
2 L di fiaschetta Erlenmyer	Carl Roth	LY98.1
Provette per collettore di frazioni 5 mL	Greiner	115101
Membrana per dialisi Spectra/Por (3,5 kDa)	spettro	132724
Unità filtrante Steritop	Merck	SCGPT01RE
attrezzatura
Collettore di frazioni	GE Sanità	Frac-920