Purificazione delle proteine basata sulla cromatografia di affinità al nichel: una tecnica per purificare le proteine ricombinanti marcate con poliistidina dal lisato cellulare batterico

Abstract

Fonte: Pokhrel, A. et al. A Saggio di purificazione e attività in vitro per una (p)ppGpp Sintetasi da Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, dimostriamo la tecnica di cromatografia di affinità al nichel per purificare gli enzimi pirofosfochinasi marcati con istidina dai batteri Clostridium difficile.

Protocollo

1. Purificazione delle proteine mediante cromatografia di affinità al nichel

1. Purificare le proteine utilizzando 1 mL di resina di acido nichel-nitriloacetico (Ni-NTA) su una colonna a gravità.
   1. Il giorno prima dell'uso, equilibrare la colonna per una notte a 4 °C con 2 mL di tampone di equilibrazione (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 0,5 mg/mL lisozima, 5 mM MgCl₂, 10 mM imidazolo, 0,25 mM DTT, 5 mM fenilmetano sulfonilfluoruro (PMSF), 10% glicerolo).
   2. Il giorno seguente portare la colonna da 4 °C a RT prima di caricare il lisato chiarificato e lasciarla riposare per ~2–3 h.
      nota: Portare la colonna all'equilibrio termico è fondamentale per evitare la formazione di bolle d'aria all'interno della colonna.
   3. Risospendere il pellet nel tampone di lisi (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, glicerolo 10%, lisozima 0,5 mg/mL, 10 mM imidazolo, 0,25 mM DTT e 5 mM PMSF).
   4. Sonicare le cellule sul ghiaccio per intervalli di 8 x 10 s, facendo una pausa di 30 s tra gli impulsi.
   5. Chiarificare il lisato mediante centrifugazione a 3,080 x g per 30 min a 4 °C utilizzando una microcentrifuga.
   6. Preparare il lisato con volumi uguali di tampone di lisi, quindi applicare il lisato chiarificato preparato sulla colonna e raccogliere il flusso.
   7. Riapplicare il flusso di lisato chiarificato alla colonna e raccogliere il flusso secondario.
   8. Lavare la colonna con il tampone di lavaggio 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 30 mM imidazolo, 10% glicerolo). Raccogli il flusso continuo.
      NOTA: L'inclusione di 5 mM di MgCl₂ nei tamponi di lavaggio e di eluizione è importante per l'attività enzimatica della proteina purificata.
   9. Lavare la colonna con il tampone di lavaggio 2 (10 mM di Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM di NaCl, 5 mM di MgCl₂, 50 mM di NaH₂PO₄ e 50 mM di imidazolo).
   10. Raccogli il flusso.
   11. Applicare 2 mL di tampone di eluizione (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM di NaCl, 50 mM di NaH₂PO₄, 10% di glicerolo e 75 mM di imidazolo). Raccogliere il flusso in due frazioni di 1 mL ciascuna.
       nota: La colonna dopo questa fase può essere conservata in un tampone di equilibrio a 4 °C se la stessa proteina verrà purificata nel successivo saggio di purificazione. La colonna può essere utilizzata fino a 3 volte se conservata correttamente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Resina Ni-NTA	G Bioscienze	786-940/941
Colonne a gravità monouso Pierce, 10 mL	Termo Scientifico	Codice 29924
Dispositivo per dialisi Spectra/ Por float-A-lyzer G2 da 1 ml (MWCO: 20 kD)	spettro	G235033
Processore ad ultrasuoni	Sonics	VC-750
Microcentrifuga con rotore D3024/D3024R	Scilogex