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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Estrazione dei lipidi totali non legati alla violenza covalente dai micobatteri (Figura 1)
- Grattare 0,2 g di micobatteri da un terreno solido e aggiungerlo a una provetta di vetro con un tappo a vite in politetrafluoroetilene (PTFE). Aggiungere una soluzione composta da 5 mL di cloroformio e 10 mL di metanolo (cloroformio:metanolo, 1:2).
nota: Quando si utilizzano solventi organici, è necessario utilizzare solo recipiente di vetro. Non sono ammessi contenitori di plastica. Inoltre, sono necessari tappi a vite in PTFE per bottiglie.
cautela: Il cloroformio è una sostanza potenzialmente tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: Il metanolo è una sostanza potenzialmente tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
- Lasciare la provetta in costante agitazione per una notte per estrarre i lipidi non legati alla covalente dalla superficie cellulare micobatterica.
nota: Se non è disponibile una piattaforma di agitazione orbitale, l'agitazione costante può essere sostituita da un'agitazione manuale periodica il più frequentemente possibile.
- Coprite un imbuto di vetro con una carta da filtro, filtrate i solventi organici e raccoglieteli in un tubo di vetro.
- Utilizzare un flusso di azoto gassoso per far evaporare la fase liquida nel tubo. Riempire la provetta con azoto gassoso, coprire e conservare a 4 °C.
nota: Collegare una pipetta di vetro Pasteur al flusso di azoto gassoso per far evaporare in modo specifico il tubo desiderato. Inoltre, mantenere il tubo all'interno di un riscaldatore a blocco secco per tubi a 37 °C. Quando il solvente evapora, riempire la provetta con azoto gassoso prima di chiuderla.
- Aggiungere 15 mL di una soluzione di cloroformio:metanolo (2:1) ai detriti cellulari. Lasciare la provetta in costante agitazione per una notte per estrarre i lipidi non legati alla covalente dalla superficie cellulare del micobatterio.
nota: Se non è disponibile una piattaforma di agitazione orbitale, l'agitazione costante può essere sostituita da un'agitazione manuale periodica il più frequentemente possibile.
- Lasciate riposare il composto per 1 ora. Con una pipetta Pasteur, recuperare i solventi organici. Coprire un imbuto di vetro con una carta da filtro e filtrare i solventi organici e raccoglierli nello stesso tubo di vetro precedentemente utilizzato al punto 1.3. Utilizzare un flusso di azoto gassoso per far evaporare la fase liquida nel tubo. Riempire la provetta con azoto gassoso, chiuderla e conservarla nuovamente a 4 °C.
2. Estrazione dell'acido micolico mediante metanolosi acida (Figura 2A)
- Aggiungere 2-5 mL di soluzione esterificante in una provetta di vetro ermetica con tappo a vite in PTFE. Aggiungere 0,2 g di biomassa di micobatteri nel tubo di vetro.
nota: La soluzione esterificante si forma mescolando 30 ml di metanolo, 15 ml di toluene e 1 ml di acido solforico. Le cellule dei micobatteri possono essere prelevate da colture solide o, anche da cellule delipidizzate, dopo aver eseguito l'estrazione dei lipidi totali non legati ai covalenti dai micobatteri (le cellule rimanenti dopo il filtraggio nella fase 1.6).
cautela: Il toluene è una sostanza infiammabile ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: L'acido solforico è una sostanza corrosiva e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
- Mescola il contenuto con il vortex. Lasciare riposare il composto in un bagno asciutto a 80 °C per una notte.
- Lasciare raffreddare la provetta fino a raggiungere la temperatura ambiente, quindi aggiungere 2 mL di n-esano alla provetta. Mescolare il contenuto agitando per 30 s e lasciare che il tubo si depositi fino a quando non compaiono due fasi chiare.
ATTENZIONE: l'n-esano è una sostanza potenzialmente infiammabile, irritante, dannosa per l'ambiente ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
- Recupera la fase superiore corrispondente alla fase n-esano. Trasferiscilo in un nuovo tubo.
- Ripetere il passaggio 2.3. Recuperare nuovamente la fase superiore e trasferirla nello stesso tubo utilizzato nel passaggio 2.4.
- Far evaporare il contenuto del tubo utilizzando un flusso di azoto gassoso. Riempire la provetta con azoto gassoso, chiuderla e conservarla a 4 °C.
3. Estrazione dell'acido micolico mediante saponificazione e metilazione (Figura 2B)
- Grattare 0,2 g di micobatteri da un terreno solido e aggiungerli a un tubo di vetro con tappo a vite in PTFE.
- Aggiungere 2 mL di soluzione metanolo-benzene (80:20) contenente il 5% di idrossido di potassio. Mescolare il contenuto a vortice. Scaldare il composto per 3 ore a 100 °C.
cautela: Il benzene è una sostanza infiammabile, cancerogena e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
- Lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente. Aggiungere il 20% di acido solforico per acidificare i campioni e ottenere un pH = 1.
- Aggiungere 3 mL di etere etilico. Mescolare delicatamente il contenuto a vortice.
- Lasciate che le due fasi si formino assestandosi. Recuperare la fase di etere etilico e trasferirla in una nuova provetta. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre volte.
- Lavare l'estratto di etere etilico con 2 ml di acqua distillata e trasferire la parte superiore corrispondente all'etere etilico in una nuova provetta. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre volte.
- Aggiungere 2 g di solfato di sodio anidro sull'estratto di etere etilico per asciugarlo.
- Filtra le sospensioni. Evaporare il contenuto utilizzando un flusso di azoto gassoso.
- Per eseguire la fase di metilazione, sciogliere 3 g di N-nitroso-N-metil urea in una soluzione preraffreddata formata da 45 mL di etere etilico e 9 mL di KOH al 40% in acqua distillata.
cautela: La N-nitroso-N-metilurea è una sostanza tossica, irritante, cancerogena e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
- Trasferire il surnatante (diazometano) in un nuovo pallone raffreddato in ghiaccio contenente pellet di idrossido di potassio (circa 30 g).
nota: Se il surnatante non viene utilizzato immediatamente, può essere conservato a -20 °C per un massimo di 1 h.
cautela: I pellet di idrossido di potassio sono una sostanza irritante e corrosiva. Questo materiale deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: Il diazometano è altamente tossico e potenzialmente esplosivo. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare con vetro di sicurezza indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
- Aggiungere 2 mL della soluzione eterea contenente diazometano, ottenuta al punto 3.10, nell'estratto essiccato di etere etilico contenente acidi micolici, ottenuto al punto 3.8. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Far evaporare la sospensione a 40 °C. Riempire la provetta con azoto gassoso, chiuderla e conservare i lipidi metilati a 4 °C.
nota: Far evaporare il diazometano dalla soluzione eterea sotto la cappa a flusso laminare, fino a quando l'etere perde il colore giallo.
4. Analisi della cromatografia su strato sottile (TLC)
- Saturare la camera TLC in vetro. Per fare ciò, coprire una delle pareti della camera TLC con un pezzo di carta da filtro e lasciarla a contatto con la fase mobile composta dalla miscela di solventi. Posizionare il volume rimanente del solvente sul fondo della camera TLC.
nota: Il fondo della camera TLC deve essere coperto da almeno 1 cm di fase mobile. Nei presenti esperimenti, sono state utilizzate diverse fasi mobili per sviluppare le TLC. Consistevano in 85 mL di n-esano più 15 mL di etere etilico; 100 ml di diclorometano; 90 ml di cloroformio, 10 ml di metanolo e 1 ml di acqua; 30 ml di cloroformio, più 8 ml di metanolo e 1 ml di acqua; 60 ml di cloroformio, più 35 ml di metanolo e 8 ml di acqua; 95 mL di cloroformio più 5 mL di metanolo; e 90 mL di etere di petrolio (60-80 °C) più 10 mL di etere etilico.
nota: Nella TLC bidimensionale, utilizzare l'n-esano:acetone (95:5) nella prima direzione tre volte e utilizzare un singolo sviluppo con toluene:acetone (97:3) nella seconda direzione per analizzare la composizione dell'acido micolico. Per analizzare i PIM, utilizzare cloroformio:metanolo:acqua (60:30:6) nella prima direzione una volta, e utilizzare cloroformio:acido acetico:metanolo:acqua (40:25:3:6) nella seconda direzione. Per analizzare PDIM e AG, utilizzare etere di petrolio (60-80 °C):acetato di etile (98:2) nella prima direzione tre volte, e utilizzare un singolo sviluppo con etere di petrolio (60-80 °C):acetone (98:2) nella seconda direzione.
cautela: L'etere etilico è una sostanza potenzialmente tossica e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: Il diclorometano è una sostanza potenzialmente tossica e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: L'etere di petrolio è una sostanza potenzialmente infiammabile, dannosa per l'ambiente ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: L'acido acetico è una sostanza potenzialmente infiammabile e corrosiva. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: L'acetato di etile è una sostanza infiammabile e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: L'acetone è una sostanza infiammabile e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
- Chiudere la camera TLC per saturarla per almeno 20 minuti. Nel frattempo, sciogliere i lipidi presenti nella provetta di vetro in 0,2-1 mL di cloroformio.
nota: Il volume utilizzato per sciogliere i lipidi può essere modificato a seconda della concentrazione desiderata o prevista del campione.
- Applicare 10 μl di ciascuna sospensione utilizzando un tubo di vetro capillare direttamente sulla piastra TLC e lasciare asciugare il campione per 5 minuti a temperatura ambiente.
nota: I campioni devono essere applicati nella parte inferiore della piastra lasciando 1 cm per lato. I campioni devono essere separati l'uno dall'altro per almeno 0,5 cm. Una volta applicato il campione sulla piastra, le provette possono essere nuovamente evaporate con azoto gassoso e conservate a 4 °C per un ulteriore utilizzo.
- Inserire la piastra nella camera TLC satura contenente la fase mobile. Consentire l'esecuzione della fase mobile attraverso TLC.
nota: Qualsiasi movimento applicato alla camera TLC influisce sul solvente in esecuzione sulla piastra e influisce sulla mobilità dei lipidi. Nel caso di esecuzione di TLC bidimensionali, sono necessarie due camere TLC per contenere entrambi i sistemi di eluizione.
- Rimuovere la piastra dalla camera TLC quando il solvente raggiunge una distanza di 1 cm dall'estremità superiore della piastra. Lasciare la piastra sotto flusso laminare fino a quando la silice non è completamente asciugata.
nota: Nel caso dell'analisi della composizione dell'acido micolico, utilizzando n-esano e dietil-etere (85:15), ripetere i passaggi 4.4 e 4.5 altre due volte, fino a eseguire la fase mobile tre volte sulla piastra TLC.
- Rivelare la piastra con la macchia richiesta; riscaldare la piastra se necessario.
nota: Nel presente esperimento, 15-20 mL delle seguenti soluzioni sono state utilizzate per spruzzare le piastre TLC: 10% di acido molibdatofosforico idrato in etanolo fino a quando la piastra non diventa giallo brillante, seguito dal riscaldamento della piastra a 120 °C; 5% in etanolo al 20% di α-naftolo in acido solforico seguito da riscaldamento della piastra a 120 °C; Reagente blu di molibdeno (1,3% di ossido di molibdeno in acido solforico 4,2 M) fino alla comparsa di bande di fosfato o 1% di antrono in acido solforico.
cautela: L'acido molibdatofosforico idrato è una sostanza infiammabile e corrosiva. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: L'etanolo è una sostanza potenzialmente infiammabile e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
ATTENZIONE: L'1-naftolo è una sostanza infiammabile, corrosiva ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
cautela: Il reagente spray al blu di molibdeno è una sostanza corrosiva, tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
