Purificazione del baculovirus basata sulla cromatografia di affinità con eparina: una tecnica per isolare il baculovirus dal surnatante delle cellule di insetto

Abstract

Fonte: Nasimuzzaman, M. et al., Produzione e purificazione di Baculovirus per l'applicazione della terapia genica. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, dimostriamo la tecnica per isolare il baculovirus da un surnatante di cellule di insetto utilizzando la cromatografia di affinità con eparina. L'isolamento è facilitato dall'affinità tra l'eparina nella colonna e la glicoproteina dell'involucro del baculovirus.

Protocollo

1. Preparazione del sistema cromatografico

1. Preparare il sistema cromatografico risciacquando in sequenza le linee del campione e del tampone con acqua sterile, idrossido di sodio 1 N, acqua e tampone di lavaggio (20 mM di tampone fosfato di sodio contenente 150 mM di cloruro di sodio, pH 7,0) a una velocità di flusso lineare di 50 mL/min.
2. Preparare una colonna di eparina da 50 μm (10 × 10 cm, 7,9 mL di volume della colonna (CV)) eseguendo in sequenza il tampone di pulizia della colonna (5 CV sterile 20 mM di sodio fosfato contenente 2 M di cloruro di sodio, pH 7,0) e 5 CV di tampone di lavaggio a una velocità di flusso lineare di 7 mL/min.

2. Purificazione del vettore del Baculovirus

1. Configurare il sistema cromatografico come segue:
   1. Utilizzare la porta di ingresso di caricamento del campione per caricare il surnatante del baculovirus.
   2. Utilizzare la porta di ingresso del tampone A1 per caricare il tampone di lavaggio. Preparare un flacone con almeno 500 ml di tampone di lavaggio e posizionare la linea del tampone di lavaggio nel flacone.
   3. Utilizzare la porta di ingresso del tampone A2 per caricare il tampone di eluizione (20 mM di fosfato di sodio con 1,5 M di cloruro di sodio, pH 8,0). Preparare un flacone con almeno 500 ml di tampone di eluizione e posizionare la linea del tampone di eluizione nel flacone.
   4. Inserire diverse provette coniche da 50 mL nel collettore di frazioni per raccogliere il surnatante del baculovirus passante della colonna, il tampone di lavaggio e il baculovirus eluito.
2. Equilibrare la colonna di eparina con cinque volumi di colonna (CV) da 7,9 mL di tampone di lavaggio (40 mL) a una velocità di flusso lineare di 7,0 mL/min.
3. Caricare 250 mL di surnatante del baculovirus sulla colonna di eparina utilizzando la pompa del campione (porta del campione di ingresso) del sistema cromatografico a una velocità di flusso lineare di 2,0 mL/min.
4. Far funzionare 10 CV (80 mL) di tampone di lavaggio attraverso la colonna di eparina a una velocità di flusso lineare di 2,0 mL/min fino a quando la curva di assorbanza ultravioletta (UV) (280 nm) non è tornata al basale e diventa stabile.
5. Eluire le particelle di baculovirus dalla colonna di eparina da 7,9 mL con 5 CV (40 mL) di tampone di eluizione a una velocità di flusso lineare di 4,0 mL/min. Osservare un picco di eluizione acuto della proteina sul cromatogramma quando le particelle di baculovirus si dissociano dalla colonna di eparina.
6. Dopo l'eluizione, diluire immediatamente il surnatante del baculovirus eluito 10 volte utilizzando 20 mM di tampone fosfato di sodio in acqua per prevenire l'inattivazione delle particelle di baculovirus dovute allo shock osmotico durante la successiva centrifugazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Akta Avant 150	GE Sanità	28976337	Sistema cromatografico
Colonna POROS eparina da 50 μm	ThermoFisher Scientifico	4333414	Colonna di eparina
Tampone di lavaggio	Interno	Elemento non di catalogo	20 mmol/l di tampone fosfato contenente 150 mmol/l di cloruro di sodio
Tampone di eluizione	Interno	Elemento non di catalogo	20 mmol/l di tampone fosfato contenente 1,5 mol/l di cloruro di sodio
Tubo conico da 50 ml	ThermoFisher Scientifico	14-959-49A	Per la raccolta del surnatante Baculovirus
Tampone per la pulizia della colonna	Interno	Elemento non di catalogo	20 mmol/l di tampone fosfato contenente 2,0 mol/l di cloruro di sodio
Acqua sterile	Interno	Elemento non di catalogo	Per la pulizia Akta Avant
idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	Codice 1.09137	Per la pulizia Akta Avant