Cromatografia a scambio cationico: una tecnica per isolare la proteina ricombinante bersaglio dal lisato di cellule di insetto basata sulla carica superficiale netta

Abstract

Fonte: Agamasu, C. et al. KRAS4b ricombinante completamente processato: isolamento e caratterizzazione della proteina farnesilata e metilata. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la tecnica di cromatografia a scambio cationico per isolare la proteina ricombinante dal lisato proteico delle cellule di insetto.

Protocol

1. Purificazione delle proteine

1. Preparare i tamponi A-H, come mostrato nella Tabella 1.

Soluzione tampone	Agente tampone (tutti i 20 mM)	ph	NaCl (mM)	Imidazolo (mM)	MgCl2	Telecomunicazioni
un	HEPES	7.3	300	-	5	1
E	HEPES	7.3	300	35	5	1
E	HEPES	7.3	300	500	5	1
D	Mes	6,0	200	-	5	1
E	Mes	6,0	-	-	5	1
E	Mes	6,0	100	-	5	1
E	Mes	6,0	1000	-	5	1
H	HEPES	7.3	300	-	1	1

2. Preparare i materiali di purificazione (vedere la Tabella dei materiali): cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA o altri chelanti; colonna per cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC); colonna per cromatografia a scambio cationico (CEX); filtro per siringa da 0,45 μm; 2 M di imidazolo (pH = 7,5); ultracentrifuga in grado di erogare 100.000 x g; centrifuga da banco ad alta velocità in grado di erogare 4.000 x g; unità filtranti centrifughe (10 KDa NMWL); spettrofotometro in grado di leggere a 280 nm; proteasi del virus dell'incisione del tabacco his6 (TEV); e strumentazione cromatografica in grado di miscelare due soluzioni tampone, applicare soluzioni alle colonne, creare eluizioni di gradiente dalla colonna e raccogliere frazioni dalle colonne.
3. Rimuovere il lisato di cellule di insetto dalla dialisi e centrifugare a 4.000 x g per 10 minuti per rimuovere eventuali precipitati. Il campione finale dializzato e chiarificato a questo punto è spesso ancora confuso, ma può essere applicato senza ulteriori elaborazioni sulla successiva colonna CEX.
4. Preparare una colonna a scambio cationico da 20 mL (vedere la Tabella dei materiali) lavandola con tre CV di tampone G, quindi con tre CV di tampone F.
   nota: Sebbene non abbiamo valutato meticolosamente altre resine, diversi colleghi hanno riscontrato una scarsa risoluzione con resine diverse dalla resina SP Sepharose High Performance.
5. Diluire 20 mL del campione dializzato a una concentrazione finale di NaCl di 100 mM aggiungendo 20 mL di tampone E e applicare il campione diluito alla colonna di scambio cationico.
6. Continuare a caricare la colonna aggiungendo campioni appena diluiti preparati come descritto sopra al tubo di carico poiché la diluizione precedente si avvicina alla fine del carico.
   nota: La diluizione dell'intero campione in una sola volta a 100 mM di NaCl ha comportato una significativa perdita di proteina bersaglio a causa della precipitazione.
7. Lavare la colonna alla linea di base Abs280 con il tampone F. Questo richiede in genere 3 CV. La proteina viene eluita dalla colonna durante un gradiente di 400 mL (20 CV) dal tampone F al 65% del tampone G, raccolto in frazioni di 6 mL (Figura 1B).
8. Continuare a lavare la colonna per ulteriori 1,5 CV (65% Buffer G) una volta completata la pendenza.

Results

Figura 1: Gel SDS-PAGE del processo di purificazione. (A) Cattura IMAC dal lisato. FNTA/B sono le bande scure che migrano a ~48 kDa e l'His6-MBP-tev-KRAS4b è la banda scura che migra a ~67 kDa. M = scala del peso molecolare delle proteine; T = proteine totali; L = lisato chiarificato/carico della colonna; F = flusso della colonna. Le frazioni vengono eluite con un gradiente di concentrazione di imidazo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette Safe-Lock da 1,8 mL, naturali	Eppendorf	22363204
Fiale per autocampionatore con inserto interbloccato Cl SS da 11 mm	Termo Scientifico	30211SS-1232
5427R Centrifuga	Eppendor
Acetonitrile, grado HPLC	Fisher Chemical	A998-1 1L
Colonna per cromatografia a scambio cationico (CEX)	GE Healthcare Scienze della vita	29018183	HiPrep SP Sepharose ad alte prestazioni
Spettrometro di massa EMR Exactive Plus	Termo Scientifico
Fiale Gilson Tubi 7x14 mm	GE Sanità	BR-1002-12
Centrifuga ad alta velocità/da banco	Thermo Fischer Scientific	05-112-114D	Capace fino a 4.000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) proteasi	Addgene	Codice 92414	Purificato secondo Raran-Kurussi et al. (2017) Rimozione dei tag di affinità con TEV Proteasi. In: Burgess Brown N. (a cura di) Espressione genica eterologa in E.coli. Metodi di biologia molecolare, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA o altri chelanti	Millipore Sigma	P8849
Acetato di ammonio	Sigma-Aldrich	09689-250g
Gas argon	Aria gas	ARUP
acido formico	Sigma-Aldrich	F0507-500MI	Utilizzare Reagente di grado o superiore
Sistema cromatografico NGC	BioRad	78880002	Sistema cromatografico NGC QuestTM 100
Set di estrusori lipidici con supporto	LIPIDI POLARI AVANTI	610023
azoto liquido	Aria gas	NI-DEWAR
Unità filtranti centrifughe Ultra-15, 10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	membrana in PES
Filtri per centrifuga Ultracel 10K MWCO Ultra da 0,5 mL	Amicon	UFC501024
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Optima - L80K	capace di 100.000 xg
Chaps	sigma	Codice: C3023