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1. Preparazione dei buffer
- Per preparare il tampone di lavaggio ELISA, aggiungere 3,94 g di Tris-base, 8,77 g di NaCl e 1 g di albumina sierica bovina (BSA) a 1 L di acqua deionizzata (DI). Aggiungere 500 μl di polisorbato-20. Regolare il pH a 7,2 utilizzando HCl o NaOH.
- Per preparare il tampone bloccante, aggiungere 3,94 g di Tris-base, 8,77 g di NaCl e 10 g di BSA. Aggiungere 500 μL di polisorbato-20 a 1 L di acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,2 utilizzando HCl o NaOH.
- Per preparare il tampone di eluizione (PBS), aggiungere 8,01 g di NaCl, 2,7 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 a 1 L di acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,4 utilizzando HCl o NaOH.
nota: Una soluzione 10x di questo tampone può essere preparata e diluita con acqua deionizzata secondo necessità.
2. Preparazione del campione OMV
- Far crescere le cellule di A. actinomycetemcomitans fino alla fase esponenziale tardiva (densità ottica a 600 nm di 0,7). Pellettare le celle centrifugando due volte a 10.000 x g a 4 °C per 10 minuti. Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 μm.
- Concentrare il surnatante privo di batteri utilizzando filtri di cut-off a peso molecolare da 50 kDa. Ultracentrifugare la soluzione concentrata a 105.000 x g a 4 °C per 30 min.
- Risospendere il pellet in PBS e ultracentrifugare nuovamente (105.000 x g a 4 °C per 30 min.) Risospendere il pellet in 2 mL di PBS.
3. Impacchettare la colonna S-1000
- Mescolare il flacone madre di mezzo filtrante in gel con un'asta di vetro e versare in un flacone di vetro il volume necessario per riempire la colonna, più circa il 50% in eccesso (circa 135 ml). Lascia riposare queste perline fino a quando non si sono depositate, quindi decanta il liquido in eccesso. Risospendere le perle nel tampone di eluizione, in modo che la soluzione finale sia composta da circa il 70% (in volume) di gel, il 30% di tampone. Degassare la soluzione sotto vuoto.
- Montare la colonna di vetro verticalmente utilizzando un supporto ad anello e riempirla con un tampone di eluizione per bagnare le pareti della colonna. Scolare il tampone fino a quando non rimane solo circa 1 cm di tampone nella colonna.
- Senza creare bolle, pipettare con cura le perline nella colonna, riempiendo la colonna fino in cima. Continuare a drenare il tampone in eccesso durante questo processo. Assicurati di non lasciare che le perline si depositino completamente prima di aggiungere altre perline alla parte superiore della colonna. La colonna deve essere imballata ad un'altezza di circa 2 cm sotto il fondo del serbatoio della colonna.
4. Caricamento del campione e raccolta delle frazioni
- Degassare il tampone di eluizione sotto vuoto. Lavare la colonna con due volumi di colonna (180 mL) di tampone di eluizione.
- Consentire al buffer rimanente di entrare completamente nella colonna. Una volta che il tampone ha raggiunto la parte superiore dello strato di gel, pipettare con cura un campione da 2 ml contenente OMV (a una concentrazione lipidica di circa 100 - 200 nmol/L) sulla superficie delle perle, facendo attenzione a non disturbare nessuna delle perle nella parte superiore della colonna. Lasciare che il campione entri completamente nel gel, cioè quando non rimane liquido sopra lo strato di gel.
- Aggiungere con cautela e lentamente il tampone di eluizione sulla parte superiore della colonna di gel. Non disturbare lo strato superiore del gel, poiché ciò causerà la diluizione del campione.
- Posizionare una singola provetta da 50 ml sotto la colonna e aprire la colonna. Raccogliere i primi 20 ml di eluente. Aggiungere un ulteriore tampone di eluizione alla parte superiore della colonna, con attenzione, se necessario, per garantire che la colonna non sia mai asciutta.
- Posizionare una serie di provette da 1,5 mL sotto la colonna. Avviare la colonna e raccogliere una serie di campioni da 1 mL in ciascuna provetta. Durante la raccolta dei campioni, continuare ad aggiungere il tampone di eluizione nella parte superiore della colonna, se necessario. Ripetere fino a quando non sono state raccolte 96 frazioni. Arrestare la colonna.
nota: I campioni devono essere conservati a -20 °C per la conservazione a lungo termine o a 4 °C per la conservazione a breve termine fino a nuova analisi.
- Per pulire la colonna, far passare un volume della colonna (90 mL) di 0,1 M NaOH attraverso la colonna. Far scorrere due volumi di colonna (180 mL) di tampone di eluizione attraverso la colonna.