1. Produci e caratterizza l'anticorpo
- Esprimere l'anticorpo
- Scongelare un flaconcino di cellule di sospensione HEK in un pallone da 250 mL contenente 50 mL di terreno di espressione integrato con 100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 250 ng/mL di amfotericina B. Mantenere le cellule a 37 °C con l'8% di CO2 in incubatori umidificati dotati di agitatore a 125 giri/min. Dividere le cellule a 0,3-0,5 x 106 cellule/mL (ogni 2-3 giorni) almeno 2 volte prima della trasfetzione.
- Quando si raggiunge una densità di 2,5 x 106 cellule/mL (2-3 giorni dopo la scissione), preparare una soluzione fresca di 100 mM di CypK. A tale scopo, pesare 64 mg di CypK, aggiungere 2,5 mL di idrossido di sodio 0,1, agitare, centrifugare per recuperare tutte le particelle non disciolte e sonicare.
- Aggiungere 2,5 mL di CypK (100 mM in 0,1 M NaOH) a 42,5 mL di terreno di espressione integrato con antibiotici. Mescolare bene, aggiungere 250 μl di HCl 0,1 M e sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 μm.
- Diluire 50 μg di plasmidi HC e LC pKym1 a 2,5 mL con terreno sierico ridotto. In una provetta separata, diluire 135 μL di reagente di trasfezione a 2,5 mL con terreno sierico ridotto.
- Cinque minuti dopo aver preparato le soluzioni, mescolare i plasmidi e la soluzione del reagente di trasfezione e incubare per 20 minuti per consentire la formazione di complessi tra il DNA e il reagente di trasfezione.
- Nel frattempo, centrifugare 125 milioni di cellule alla densità target per 5 minuti a 500 x g, risospendere con il mezzo di espressione contenente CypK e aggiungere la miscela di reagenti DNA-trasfezione. Il CypK può essere acquistato o sintetizzato come riportato in precedenza.
- Dopo aver incubato le cellule per 20 ore, aggiungere 250 μl di potenziatori di reagenti di trasfezione inclusi nel kit.
- Raccogliere gli anticorpi dal surnatante 6-7 giorni dopo l'aggiunta di CypK (non è necessario cambiare il terreno durante l'espressione).
*In alternativa, per ottenere rese più elevate e più coerenti, è possibile generare una linea cellulare stabile come descritto in Oller-Salvia et al. 2018. In questo caso, il trastuzumab(CypK)2 viene espresso semplicemente mediante l'aggiunta di CypK 5 mM nel mezzo di espressione.
- Purifica l'anticorpo
- Centrifugare le celle per 15 minuti a 3000 x g.
- Filtrare il surnatante con un filtro da 0,45 o 0,22 μm. Se il filtro si occlude, sostituirlo con uno nuovo e continuare a filtrare. Se ciò accade dopo pochi millilitri, centrifugare il surnatante per altri 15 minuti a 7000 x g.
- Aggiungere la resina di proteina A (2 mL/100 mL di surnatante) in una colonna cromatografica in polipropilene vuota ed equilibrare la resina con almeno 5 volumi di tampone di lavaggio delle microsfere (0,1 M di fosfato di sodio, 150 mM di NaCl).
- Dividere il surnatante in due provette coniche da 50 ml e aggiungere 5 tamponi per il lavaggio delle perle (0,5 M di fosfato di sodio, 150 mM di NaCl) seguiti dalla resina di proteina A pre-equilibrata. Posizionare il tubo conico su un rullo per 3 ore a temperatura ambiente per abbassare l'anticorpo nel surnatante.
- In alternativa: aggiungere il surnatante sulla colonna con almeno il doppio del volume di resina consigliato e lasciarlo scorrere. Assicurarsi che non sia rimasta una quantità significativa di anticorpi nel surnatante da SDS-PAGE. In tal caso, eluire nuovamente il surnatante attraverso la resina.
- Trasferire la resina di proteina A con il surnatante in una colonna e lasciare che il liquido fluisca attraverso.
- Aggiungere 25 ml di tampone di lavaggio (o almeno 10 volumi di resina) e lasciar scorrere.
- Eluire l'anticorpo con 4 mL di citrato di sodio 0,1 M, pH 3, su 1 mL di tampone fosfato 1 M, 150 mM di NaCl.
- Diluire l'anticorpo con 10 mL di PBS, concentrarsi a 0,5-1 mL mediante filtrazione centrifuga e scambiare il tampone tre volte con PBS.
- Purificare i campioni mediante FPLC utilizzando una colonna BUTILICA HIC con un flusso di 0,5 mL/min e un gradiente 0-100% in 30 minuti di tampone a basso contenuto di sale (50 mM di fosfato di sodio, pH 7,0, 20% di isopropanolo) in tampone ad alto contenuto di sale (1,5 M (NH4)2, SO4, 50 mM, fosfato di sodio, pH 7,0, 5% di isopropanolo). Raccogliere tutte le frazioni e monitorare l'eluizione a 280 nm. Piccole quantità (< 1 mg) possono essere purificate con HPLC-HIC nelle condizioni descritte al punto 2.4 per massimizzare la resa e la purezza.
- Raggruppare le frazioni che contengono anticorpi, diluirle ad almeno 4 mL con PBS, concentrarle mediante filtrazione centrifuga e scambiare tre volte il tampone con PBS.
- Quantificare l'anticorpo
- Ottenere una concentrazione approssimativa misurando l'assorbanza a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
- Se è necessaria una misurazione accurata, utilizzare un kit ELISA per misurare le IgG umane. Per una stima approssimativa, utilizzare SDS-PAGE con un colorante a base di Coomassie come segue:
- Preparare gli standard diluendo sei volte il doppio di uno standard di trastuzumab quantificato mediante ELISA a 1 mg/mL.
- Far bollire gli standard e i campioni a circa 0,25 mg/mL in tampone di carico ridotto.
- Eseguirli in un Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% utilizzando un tampone MES-SDS e colorare con un colorante a base di Coomassie. Infine, misurare la densità del colore della banda corrispondente alla catena leggera o pesante utilizzando ImageJ e interpolare il segnale dai campioni nella curva standard.
- Conservare l'anticorpo a 4 °C.
2. Coniugare l'anticorpo e caratterizzare l'ADC
- Coniugare l'anticorpo con la molecola contenente tetrazina
- Diluire 10 equivalenti molari di tetrazina-vcMMAE (4 μL, 3,4 mM in dimetilsolfossido (DMSO)) con 20 μL di acetonitrile e 76 μL di PBS in una piccola provetta conica (ad es. provetta per PCR).
- Aggiungere 1 molare equivalente di trastuzumab(CypK)2 (100 μL, 2 mg/mL in PBS), mescolare accuratamente e lasciare reagire per 3 ore a temperatura ambiente (25 °C) per formare trastuzumab(MMAE)2.
nota: Altre molecole come la tetrazina-5-TAMRA possono essere collegate all'anticorpo al posto della tetrazina-vcMMAE utilizzando questo protocollo.
- Purifica l'ADC
- Pre-equilibrare una colonna di centrifuga per esclusione dimensionale con PBS seguendo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere l'intero volume della reazione sulla colonna di centrifuga e centrifugare a 1500 x g per 1 minuto.
- Quantificare l'ADC e analizzare il coniugato mediante SDS-PAGE
- Quantificare l'ADC come descritto al punto 1.3.2. misurando la densità di colore della catena leggera su una SDS-PAGE utilizzando l'anticorpo non modificato per la curva standard.
- La catena pesante dovrebbe essersi leggermente spostata, mostrando un aumento del peso molecolare durante la coniugazione.
Nota: Se l'anticorpo viene modificato con un fluoroforo come nel trastuzumab (TAMRA)2, solo la banda corrispondente alla catena pesante deve mostrare fluorescenza in gel prima della colorazione.
- Analisi del coniugato mediante HPLC-HIC
- Equilibrare la colonna HPLC-HIC con tampone A al 100% (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM di sodio fosfato pH 7,0, 5% isopropanolo) per 5 minuti.
- Miscelare 15 μL (67 pmol) di una soluzione da 1 mg/mL di trastuzumab(CypK)2 con 15 μL di 2x tampone A in un flaconcino. Quindi programmare un'iniezione da 10 μl nell'HPLC.
- Eluire in un flusso isocratico di 1 mL/min con tampone A al 100% per 1 minuto, seguito da un gradiente di 15 minuti dal 100 allo 0% del tampone A in B (50 mM di fosfato di sodio pH 7,0, 20% isopropanolo). Monitorare l'eluizione a 280 nm.
- Calcola il DAR integrando il picco corrispondente a ciascuna specie e utilizzando le aree risultanti nella seguente equazione:
DAR = (1x trastuzumab(MMAE) + 2x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
Il tempo di ritenzione previsto per trastuzumab(CypK)2 è di 7,5-8,0 minuti, per trastuzumab(CypK, MMAE) è di 9,1-9,6 minuti e per trastuzumab(MMAE)2 è di 10,5-11,0 minuti.