Cromatografia ad esclusione dimensionale con rilevamento a fluorescenza: una tecnica per identificare l'integrità delle proteine di membrana fluorescenti dopo solubilizzazione con detergente

Abstract

Fonte: Bird, L. E., et al. Screening dell'espressione basato su proteine fluorescenti verdi delle proteine di membrana in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, dimostriamo una tecnica cromatografica di esclusione dimensionale con rilevamento a fluorescenza per lo screening della stabilità delle proteine di membrana fuse con proteina fluorescente verde (GFP) in Escherichia coli dopo solubilizzazione con detergente. Le proteine che presentano un picco simmetrico nel profilo di esclusione dimensionale con poca o nessuna GFP libera indicano proteine purificate con degradazione e aggregazione minime, che possono essere successivamente selezionate per l'analisi struttura-funzione.

Protocollo

1.Solubilizzazione e analisi della frazione di membrana

1. Scongelare la frazione di membrana (se necessario) e, per ciascun detergente da utilizzare per la solubilizzazione, aliquotare 900 μl della sospensione di membrana in una provetta per microcentrifuga in poliallomero da 1,5 ml.
2. Aggiungere 100 μl di ciascun detergente appena preparato (10% p/v di soluzioni di DDM, DM, Cymal-6 e LDAO) a una concentrazione finale dell'1% nella provetta da 1,5 ml specificata. Per la solubilizzazione delle proteine della membrana eucariotica, ai detergenti può essere aggiunto colesterolo emiuccinato (concentrazione finale 0,2%).
3. Incubare le miscele a 4 °C per 1 ora agitando leggermente.
4. Pellettare la frazione insolubile del detergente con un'ultracentrifuga da banco, assicurandosi che le provette siano almeno mezze piene, a 150.000 g a 4 °C per 45 minuti e che mantengano il surnatante.
   nota: L'efficacia della solubilizzazione con detergente può essere stimata utilizzando un lettore di piastre fluorescente misurando la fluorescenza GFP delle membrane solubilizzate con la frazione insolubile del detergente risospesa nello stesso volume di PBS.
5. Analizzare la mono-dispersità dei diversi complessi proteici di membrana utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale rilevata in fluorescenza (FSEC).
6. Per l'analisi FSEC, equilibrare una colonna di esclusione dimensionale con un ampio intervallo di frazionamento, ad esempio da 5.000 a 5.000.000 di peso molecolare, con tampone corrente (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) a una velocità di flusso di 0,3 ml/min. Utilizzare questo tampone per tutti i campioni, ovvero non viene modificato per ogni detergente testato.
7. Iniettare 100 μl di membrane solubilizzate sulla colonna a una velocità di flusso di 0,3 ml/min. Monitorare il profilo di eluizione utilizzando l'ottica a fluorescenza (eccitazione a 488 nm ed emissione a 512 nm). Se non è disponibile un monitor a fluorescenza in linea, raccogliere le frazioni e leggere la fluorescenza in un lettore di piastre.
8. Importa i dati sul volume di eluizione e sull'intensità della fluorescenza in un foglio di calcolo per la visualizzazione grafica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Colesterolo emiuccinato	Sigma-Aldrich	Codice: C6512
CYMAL-6 (6-cicloesil-1-esil-βD-maltoside)	Anatrace	C326
DDM (n-dodecil β-maltoside)	Generon	D97002
DM (n-decil β-maltoside)	Generon	D99003
LDAO (N,N-Dimetil-ndodecilammina N-ossido)	Generon	D71111
Standard per proteine fluorescenti BenchMark	Tecnologie per la vita	LC5928
Optima L-100 Ultracentrifuga con rotore 45-Ti	Beckman Coulter	393253
Ultracentrifuga Optima Max-XP con rotore TLA-55	Beckman Coulter	393315
Prominence UFLC con rivelatore a fluorescenza RF-20A	Shimadzu
Colonna di esclusione dimensionale Sepharose 6 10/300 GL	GE Sanità	Codice 17-5172-01