Cromatografia di affinità basata su DFE: una tecnica per la purificazione di anticorpi monoclonali 2F5 da un campione grezzo utilizzando condizioni di eluizione basate su elevata forza ionica

Abstract

Fonte: Knödler, M. et al., Agarosio reticolato attivato per il rapido sviluppo di resine per cromatografia di affinità - Cattura di anticorpi come caso di studio. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive una tecnica di cromatografia di affinità per purificare gli anticorpi monoclonali 2F5 utilizzando i ligandi DsRed-2F5-Epitope o DFE. Gli anticorpi monoclonali 2F5 purificati sono farmaci essenziali in immunoterapia.

Protocol

1. Test della purificazione di mAb da estratti di piante chiarificate

1. Preparare 100 ml di estratto vegetale chiarificato contenente 2F55 o il surnatante del sistema di espressione cellulare preferito, anch'esso contenente 2F5.
2. Preparare il tampone di equilibrio (20 mM di fosfato di sodio, 500 mM di cloruro di sodio, pH 7,4), il tampone di eluizione a basso pH (0,05 M di citrato, 0,05 M di cloruro di sodio, pH 4,0-3,25) e il tampone di eluizione ad alta forza ionica (1,0-4,0 M di cloruro di magnesio, 0,1 M HEPES, pH 8,0)
3. Lavare il sistema cromatografico con i tamponi. Montare una colonna di affinità DFE (fare riferimento al testo principale del protocollo) sul sistema cromatografico ed equilibrare con 5 CV di tampone di equilibrazione a una velocità di flusso di 1,0 mL ^min-1. Monitorare l'assorbanza UV a 280 nm.
   nota: Il caricamento di estratto vegetale o surnatante di coltura cellulare sulla colonna può causare un aumento della contropressione. Impostare un avviso di alta pressione a 0,2 MPa per evitare danni al sistema cromatografico o alla colonna DFE.
4. Caricare 80 mL di estratto vegetale chiarificato o surnatante (fase 1.1) sulla colonna a una velocità di flusso di 0,5 mL min-1 per garantire un tempo di contatto di 2 min. Raccogliere i campioni a flusso continuo in frazioni di 2 mL per la ricostruzione della curva di sfondamento. Conservare i campioni a flusso continuo a 4 °C se non è possibile un'analisi immediata del campione.
5. Lavare la colonna con 6 CV di tampone di equilibratura. Raccogli un campione del lavaggio all'inizio, a metà e alla fine di questa fase.
6. Eluire l'anticorpo monoclonale 2F5 con 5 CV di tampone di eluizione a basso pH o tampone di eluizione ad alta forza ionica (0,1 M HEPES, 1,25 M cloruro di magnesio, pH 8,0). Raccogli la frazione DFE quando il segnale UV 280 nm è aumentato a 5 mAU sopra la linea di base.
   1. Ottimizzare il tampone di eluizione per ogni coppia epitopo-anticorpo. Per 2F5, il cloruro di magnesio 1,25 M ha raggiunto un equilibrio ottimale tra recupero del prodotto e stabilità del ligando.
      nota: La soluzione di cloruro di magnesio è soggetta a precipitazioni. Pertanto, sciogliere il cloruro di magnesio in ~700 ml di acqua. Sciogliere separatamente l'HEPES in 100 ml di acqua e regolare il pH a 8,0. Aggiungere la soluzione di cloruro di magnesio disciolto alla soluzione HEPES e aggiungere acqua fino a un volume finale di 1,0 L. Non regolare il pH dopo aver sciolto il cloruro di magnesio perché ciò causerà precipitazioni.
7. Analizza tutti i campioni prelevati durante le fasi 1.4-1.6 utilizzando il metodo Bradford, l'elettroforesi su gel di litio dodecil solfato-poliacrilammide (LDSPAGE) e la spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie (SPR).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DsRosso	Fraunhofe IME	n/a	Norma
HiTrap Sepharose HP attivato da NHS, 1 mL	GE Helthcare	Codice 17-0716-01	Colonne per cromatografia
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Componente buffer
cloruro di magnesio	Carl Roth GmbH	KK36.2	Componente buffer
IL PH 3110	WTW	2AA110	Misuratore di pH
Sephadex G-25 destrano, reticolato	GE Helthcare	17003301	Resina per cromatografia
cloruro di sodio	Carl Roth GmbH	P029.2	Componente buffer
Citrato di sodio	Carl Roth GmbH	HN13.2	Componente buffer