Saggio dell'attività enzimatica basato sulla cromatografia su strato sottile: una tecnica per determinare l'attività della pirofosfochinasi in vitro utilizzando la cromatografia su strato sottile

Abstract

Fonte: Pokhrel, A., et al. A Saggio di Purificazione e Attività In Vitro per una (p)ppGpp Sintetasi da Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra un test enzimatico basato sulla cromatografia su strato sottile per determinare l'attività della pirofosfochinasi utilizzando nucleotidi radiomarcati. Il metodo fornisce informazioni sulla sintesi nucleotidica e sulle reazioni di fosfotrasferimento.

Protocollo

1. Saggio dell'attività proteica mediante cromatografia su strato sottile

1. Preparare la piastra per cromatografia su strato sottile (TLC).
   1. Preparare le piastre di polietilenimmina (PEI)-cellulosa lavandole in acqua deionizzata. Mettere le piastre in una camera di vetro con acqua distillata a doppia profondità di ~0,5 cm.
   2. Lasciare che l'acqua migri verso la parte superiore della piastra.
      NOTA: Il lavaggio delle lastre non è strettamente necessario, poiché le lastre possono essere utilizzate senza di esso, ma il lavaggio aumenta la nitidezza delle immagini risultanti. Il lavaggio delle piastre in due direzioni perpendicolari garantisce inoltre che eventuali contaminanti presenti nella resina siano isolati in un angolo della piastra (Figura 1).
   3. Estrarre le piastre dalla camera di vetro e lasciarle asciugare su una griglia da banco per una notte (12-18 ore).
   4. Segna le lastre asciutte a 2,0 cm da un bordo con una matita morbida per indicare dove verranno applicati i campioni per TLC. Per campioni da 2 μl, applicare campioni a una distanza non inferiore a 1,0 cm l'uno dall'altro (Figura 1).
      NOTA: Ciò consente una chiara separazione tra i punti adiacenti, che è fondamentale per la quantificazione del segnale. Finché la resina di cellulosa non viene graffiata, piccoli segni di matita sulla superficie non interferiranno con la migrazione del solvente.
   5. Quando pianifichi gli esperimenti, lascia sempre un punto su ogni piatto inutilizzato.
      NOTA: In questo modo si otterrà una corsia vuota per la quantificazione del campione (Figura 1). Una piastra TLC da 20 cm avrà spazio per 19 spot.
2. Saggio dell'attività enzimatica
   1. Preparare una miscela tampone 5x contenente 50 mM di Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM di acetato di ammonio, 10 mM di KCl, 1 mM di DTT e 0,6 mM di ATP (adenosina trifosfato).
      NOTA: Questa miscela può essere preparata in grandi quantità e congelata in aliquote da 10 μl per un uso successivo. Non sottoporre la miscela a più cicli di congelamento-scongelamento.
   2. Preparare reazioni individuali contenenti 3 μM di RSH (enzimi omologhi Rel/Spo), 1x miscela tampone, 0,6 mM di GDP (guanosina difosfato), 1,2 mM di MgCl₂. Aggiungere 1,0 μCi di ^γ-32P-ATP (ATP radiomarcato) per 10 μL di reazione e utilizzare acqua priva di nucleasi per portare la reazione al volume desiderato. Aggiungere l'RSH dopo che gli altri componenti sono stati miscelati, poiché l'aggiunta di RSH alla miscela contenente nucleotidi avvia il saggio di attività enzimatica.
      NOTA: Il volume finale della reazione dipenderà dal numero di punti temporali campionati. Per campionare 2 μL/punto temporale, assemblare 10 μL di miscela di reazione per ogni 4 punti temporali.
   3. Per controllare l'idrolisi dell'ATP dalla contaminazione dell'attività nucleasica, assemblare una reazione da 10 μL che non contiene proteine e incubarla in parallelo. Individuare campioni da 2 μL a t = 0 e alla fine dell'esperimento per assicurarsi che l'ATP non sia stato idrolizzato in assenza di proteine.
   4. Immediatamente dopo l'aggiunta di RSH, rimuovere 2 μl e posizionarlo sulla piastra di cellulosa PEI marcata come campione t = 0 min.
   5. Incubare la reazione a 37 °C, rimuovendo 2 μL di aliquote nei punti temporali desiderati.
      NOTA: L'attività enzimatica cessa quando il campione viene adsorbito sulla piastra di cellulosa. Attendere 10-30 minuti dopo l'aggiunta dell'ultimo punto alla piastra prima dello sviluppo per garantire il completo adsorbimento e l'asciugatura del campione.
3. Cromatografia su strato sottile
   1. Riempire la camera cromatografica con 1,5 M 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,64) a una profondità di 0,5 cm.
      NOTA: Il volume necessario dipenderà dalle dimensioni della vasca per cromatografia. Qualsiasi contenitore di vetro con un fondo livellato sufficientemente largo da consentire l'inserimento della lastra TLC senza piegarsi può essere utilizzato come vasca di sviluppo con l'aggiunta di un coperchio. La lastra TLC può essere tagliata in strisce più strette con una lama di rasoio pulita per consentire lo sviluppo in un bicchiere di vetro ricoperto da una pellicola di plastica.
   2. Immergere il bordo inferiore della piastra nel solvente. Lasciare che il solvente migri verso la parte superiore della piastra (~90 min).
      NOTA: Mentre la migrazione del solvente si arresta nella parte superiore della piastra e i campioni non vengono persi o fatti scorrere insieme durante un'immersione più lunga, le piastre non devono essere lasciate nel solvente durante la notte. Immersioni superiori a 4 ore possono causare il distacco della resina dal supporto della lastra e la perdita di segnale.
   3. Rimuovere la piastra dal serbatoio per cromatografia e posizionarla su uno stendibiancheria da banco.
   4. Lasciare asciugare la piastra all'aria durante la notte.
      NOTA: L'asciugatura può essere accelerata utilizzando un asciugacapelli. La secchezza può essere valutata dal colore della resina, che si scurisce quando è bagnata e torna al colore di una lastra inutilizzata quando è completamente asciutta.
   5. Dopo che la lastra è asciutta, avvolgerla in una pellicola di plastica per evitare il trasferimento di materiale radioattivo alla cassetta di imaging e analizzarla mediante autoradiografia (Figura 2).
4. analisi dei dati
   1. Esporre la piastra di cellulosa PEI contenente reazioni separate a una cassetta phosphorimager per 4 ore a temperatura ambiente.
      NOTA: Questa è un'esposizione sufficiente per produrre un'immagine molto nitida utilizzando le concentrazioni indicate di ^γ-32P-ATP fresco. Se si utilizzano quantità inferiori di substrato radiomarcato, il tempo di esposizione può essere aumentato a 12-16 ore.
   2. Immagina la cassetta su un phosphorimager.
   3. Utilizzando un software di imaging con un'interfaccia utente grafica, è possibile disegnare le regioni di interesse (ROI) selezionando Disegna rettangolo e utilizzando il mouse per disegnare ROI rettangolari attorno a un'intera corsia e ai punti ATP e ppGpp (guanosina tetrafosfato) contenuti all'interno di tale corsia (Figura 2).
   4. Utilizzare i comandi Seleziona, Copia e Incolla (o i comandi corrispondenti in base al software di imaging utilizzato) per disegnare ROI identici all'interno delle altre corsie per garantire che le ROI misurino il segnale all'interno di aree identiche in ciascuna corsia. Includi le ROI di una corsia inutilizzata, da utilizzare come spazi vuoti.
   5. Utilizzo del pulsante Analizza | Strumenti | Responsabile del ROI | Aggiungi i comandi del software di imaging, seleziona tutte le ROI disegnate sulla lastra di cellulosa PEI.
   6. Utilizzo del pulsante Analizza | Imposta le misure | Comandi di misurazione, quantificazione dell'intensità del segnale all'interno di ciascun ROI ed esportazione delle misurazioni come foglio di calcolo (Figura 2). Sottrai i valori di ROI vuoti dai segnali sperimentali.
      
   7. Calcola quale percentuale del segnale cancellato all'interno di ciascuna corsia è attribuibile ad ATP e ppGpp utilizzando le formule.
      NOTA: Le ROI possono essere ricavate e quantificate utilizzando un software commerciale compatibile con il phosphorimager o il software ImageJ (National Institutes of Health) disponibile gratuitamente.

Risultati

Figura 1: Preparazione delle piastre TLC. (A) Le lastre vengono lavate in una dimensione mettendo il bordo inferiore in acqua (blu). I contaminanti (gialli) migrano verso la parte superiore della piastra con il solvente. (B) Dopo che una lastra si è asciugata completamente, viene lavata in una seconda dimensione ruotandola di 90° rispetto al primo lavaggio e consentendo nuovamente all'acqua di migrare ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vasca di sviluppo per cromatografi su strato sottile (TLC)	Azienda generale di soffiatura del vetro	80-3
Lastre di polietilenimina (PEI) e cellulosa (20 cm x 20 cm, spessore 100 μm) con supporto in poliestere	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml di derivazione, 100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
Adenosina 5'-trifosfato (ATP) 100 mM	Bio Base Canada	AB0311
Guanosina-5'-difosfato sale disodico (GDP)	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
Schermo al fosforo di stoccaggio	GE Healthcare Scienze della vita	Schermo al trizio BAS-IP TR 2040 E
Storm 860 phosphorimager	GE Healthcare Scienze della vita	-