$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC) per semi-quantificare la quantità di diversi lipidi, tra cui colesterolo, fosfolipidi e sfingomielina
- Preparare le seguenti quattro soluzioni per la corsa e le soluzioni coloranti.
- Soluzione 1: Mescolare acetato di etile (26,6%), 1-propanolo (26,6%), cloroformio (26,6%), metanolo (26,6%) e cloruro di potassio (9,6%). Preparare KCl sciogliendo 0,25 g di KCl in 100 mL di acqua di qualità HPLC.
- Soluzione 2: Mescolare n-esano (73%), etere etilico (23%) e acido citrico (2%).
- Soluzione 3: 100% n-esano.
- Preparare la soluzione colorante mescolando acqua distillata (90 ml) con 7,5 g di solfato di rame, quindi aggiungere 10 ml di acido fosforico.
- Riempire fino a 5 mm di ciascuna soluzione in una camera di vetro separata. Aggiungere qualsiasi tipo di carta da filtro per aumentare la velocità di funzionamento in ogni camera.
- Pre-incubare una lastra di vetro HPTLC silica gel 60 60 da 20 x 10 cm nella prima soluzione di corsa fino a quando la soluzione di corsa non raggiunge la parte superiore della piastra. Quindi asciugarlo per 10 minuti a 110 °C.
nota: Queste piastre possono essere conservate per un uso futuro in un foglio di alluminio e asciugate per 10 minuti a 110 °C prima dell'uso.
- Sciogliere un pellet lipidico ottenuto da neutrofili derivati da sangue periferico umano in 200 μl di soluzione di cloroformio/metanolo (1:1) e incubare per 15 minuti a 37 °C per scioglierlo.
- Utilizzare un righello e una matita morbida per contrassegnare i punti di caricamento per il numero desiderato di campioni, più almeno uno standard. Segnare la distanza di corsa a circa 4 cm e 6 cm rispettivamente per la prima e la seconda soluzione di corsa.
- Per caricare i campioni, lavare la siringa da 10 μl 3 volte in cloroformio/metanolo (1:1) prima di caricare ogni nuovo campione. Caricare 10 μl di ciascun campione a goccia, cercando di concentrare il campione su un'area il più piccola possibile. I campioni devono essere caricati almeno in duplicati.
- Posizionare la piastra verticalmente nella prima camera con la soluzione di scorrimento 1 (passaggio 1.1.1). Assicurarsi che la piastra sia parallela alla parete della camera di vetro per ottenere una velocità di migrazione uniforme.
- Una volta che la linea del solvente ha raggiunto il primo segno, rimuovere la piastra, asciugarla e posizionarla nella seconda soluzione. Ripetere passaggi simili per la seconda e per la terza soluzione in esecuzione; lasciare la piastra nella soluzione fino a quando la parte anteriore del solvente raggiunge la parte superiore della piastra, quindi rimuoverla e asciugarla a RT per 1 minuto.
- Mettere la piastra in una soluzione di solfato di rame per 7 s. Togliere la piastra, asciugarla accuratamente e cuocerla in forno per 7 minuti a 170 °C. Attendere che la piastra si raffreddi.
- Utilizzando un software di cromatografia su strato sottile e analisi su gel, nonché un software di elaborazione delle immagini, eseguire la scansione e l'analisi per identificare le bande risolte di lipidi.