Elettroforesi su gel di poliacrilammide: una tecnica analitica per rilevare solfati di eparan di varie lunghezze di catena isolati dal tessuto polmonare di topo

Abstract

Fonte: LaRiviere, W. B. et al., Rilevamento di glicosaminoglicani mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e colorazione con argento. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra la procedura di separazione dei solfati di eparan isolati dal tessuto polmonare di topo utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide.

Protocollo

1. Elettroforesi su gel di poliacrilammide di glicosaminoglicani isolati e purificati

1. Preparare in anticipo le soluzioni necessarie per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) (Tabella 1).
   nota: Selezionare la percentuale di acrilammide della soluzione in gel risolutiva in base alle dimensioni dei glicosaminoglicani che si prevede siano nel campione. il 15% è raccomandato per la risoluzione di frammenti più grandi (di lunghezza superiore a 30 subunità disaccaridiche); 22% per frammenti più piccoli (<20 subunità disaccaridiche di lunghezza).
2. Posizionare la cassetta vuota nel serbatoio PAGE. Fondere il gel risolutivo come segue: in una provetta da 15 mL, mescolare 10 mL di soluzione di gel risolutivo, 60 μL di persolfato di ammonio al 10% (deve essere preparato al momento) e 10 μL di TEMED (aggiungere TEMED per ultimo). Capovolgere delicatamente il tubo 2-3 volte. Utilizzare la pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di cui sopra a 10 mL alla cassetta. Sovrapporre con 2 mL di acqua deionizzata e filtrata e lasciare polimerizzare il gel risolutivo per 30 min.
   nota: Il seguente protocollo PAGE è stato ottimizzato per un sistema PAGE verticale che utilizza cassette di colata spesse 13,3 x 8,7 cm (larghezza x lunghezza) di 1,0 mm con un volume totale di circa 12 ml. È possibile utilizzare altri sistemi a cassette, ma possono richiedere l'ottimizzazione da parte dell'utente finale.
3. Dopo che il gel risolutivo si è completamente polimerizzato, scartare l'acqua sovrapposta e gettare il gel di impilamento come segue: in una provetta da 15 mL, mescolare 3 mL della soluzione di gel da impilare, 90 μL di persolfato di ammonio al 10% (deve essere preparato al momento), 3 μL di TEMED (aggiungere TEMED per ultimo).
4. Capovolgere delicatamente il tubo 2-3 volte. Utilizzare una pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di gel di impilamento sul gel risolutivo solidificato; Riempire la cassetta fino all'orlo. Inserire completamente il pettine incluso con il set-up. Lasciare polimerizzare il gel da impilare per 30 minuti.
5. Una volta che il gel si è polimerizzato, assicurarsi che la striscia di nastro sia stata rimossa dalla parte inferiore della cassetta e riposizionare la cassetta nel gruppo serbatoio PAGE.
6. Riempire le camere superiore e inferiore rispettivamente con il tampone della camera superiore e inferiore.
7. Sciogliere i campioni essiccati del passaggio 1.11.4 nel volume minimo necessario di acqua deionizzata e filtrata (al massimo, il 50% del volume dei pozzetti nel gel PAGE). Miscelare 1:1 con il tampone di caricamento del campione. Caricare i campioni e le "scale" dell'oligosaccaride HS (vedere la Tabella 1) nel gel.
8. Pre-eseguire il gel per 5 minuti a 100 V. Quindi far scorrere il gel a 200 V per 20-25 minuti (per un gel risolutore di poliacrilammide al 15%), 40-50 minuti (per un gel risolutore di poliacrilammide al 18%), 90-100 minuti (per un gel risolutore di poliacrilammide al 22%).
   nota: Potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione del tempo di funzionamento a 200 V. Il rosso fenolo migra davanti agli oligosaccaridi di eparina che sono lunghi 2 subunità polimeriche (cioè grado di polimerizzazione 2 o dp2); Il blu di bromofenolo migra prima di DP10-DP14. I migliori risultati si ottengono quando la tensione viene applicata in modo tale che la banda rossa del fenolo migri quasi, ma non del tutto, verso il fondo del gel. Regolare il tempo di esecuzione di conseguenza.

Risultati

Tabella 1: Soluzioni necessarie per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide di glicosaminoglicani purificati. Tutte le soluzioni devono essere filtrate (0,22 μm) prima dell'uso.

NOTA: Tutte le soluzioni devono essere filtrate (0.22μm) prima dell'uso.
soluzione	ricetta

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Persolfato di ammonio (solido)	ThermoFisher Scientifico	BP179-25	Grado di elettroforesi
Sistema di purificazione dell'acqua Barnstead GenPure Pro	ThermoFisher Scientifico	10-451-217PKG	Qualsiasi sistema di deionizzazione/purificazione dell'acqua è un sostituto accettabile
Acido borico (solido)	ThermoFisher Scientifico	A73-500	Grado di biologia molecolare
Blu bromfenolo (solido)	ThermoFisher Scientifico	B392-5
Criterio: cassetta vuota per PAGE (spessore 1,0 mm, 12+2 pozzetti)	Bio-Rad	3459901	Qualsiasi sistema di cassette di colata PAGE di 1,0 mm di spessore sarà sufficiente
Criterio PAGE Sistema di celle (cella e alimentatore)	Bio-Rad	1656019	Qualsiasi sistema PAGE verticale in gel comparabile funzionerà)
Sale disodico EDTA (solido)	ThermoFisher Scientifico	02-002-786	Grado di biologia molecolare
Glicina (solida)	ThermoFisher Scientifico	G48-500	Grado di elettroforesi
Acido cloridrico (liquido)	ThermoFisher Scientifico	A466-250
N,N'-metilene-bis-acrilammide (solido)	ThermoFisher Scientifico	BP171-25	Grado di elettroforesi
Rosso fenolo (solido)	ThermoFisher Scientifico	P74-10	Acido libero
Saccarosio (solido)	ThermoFisher Scientifico	BP220-1	Grado di biologia molecolare
TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiammina)	ThermoFisher Scientifico	BP150-20	Grado di elettroforesi
Base Tris (solida)	ThermoFisher Scientifico	BP152-500	Grado di biologia molecolare
Unità filtrante sottovuoto, monouso, PES poro 0,22uM, volume 500mL	ThermoFisher Scientifico	Codice: 569-0020	Volumi alternativi e materiali filtranti accettabili
Acrilammide (solido)	ThermoFisher Scientifico	BP170-100	Grado di elettroforesi
Decasaccharide derivato dall'eparina (dp10)	Galeno scientifico	HO10
Esasaccaharde derivato dall'eparina (dp6)	Galeno scientifico	HO06
Oligosaccaride derivato dall'eparina (dp20)	Galeno scientifico	HO20