Elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato per l'analisi delle proteine: una tecnica per separare e visualizzare le proteine in base al peso molecolare

In questo articolo

Abstract

Fonte: Sultana, S. et al. Estrazione e visualizzazione di aggregati proteici dopo il trattamento di Escherichia coli con un fattore di stress proteotossico. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra una tecnica di separazione denaturante basata su poliacrilammide per proteine. Questa tecnica aiuta nell'identificazione preliminare delle proteine in base al loro peso molecolare.

Protocollo

1. Separazione e visualizzazione di aggregati proteici estratti utilizzando SDS-PAGE

Preparare un gel di poliacrilammide SDS al 12%
1. Per due gel di separazione, pipettare 5,1 mL di acqua bidistillata (ddH₂O), 3,75 mL di Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 mL di SDS al 20% (p/v), 6 mL di soluzione di acrilammide/bisacrilammide al 30% (29:1), 75 mL di persolfato di ammonio al 10% p/v e 10 mL di tetrametiletilendiammina (TEMED) in una provetta da centrifuga da 15 mL e mescolare delicatamente senza introdurre bolle d'aria. Versare il gel utilizzando una pipetta da 1 ml all'interno delle lastre di vetro, lasciando i 2 cm superiori liberi dalla miscela. Aggiungere il 70% di etanolo sulla parte superiore del gel separatore e consentire un'interfaccia uniforme tra i due strati.
2. Dopo la polimerizzazione del gel separatore, preparare il gel di impilamento pipettando 1,535 mL di ddH₂O, 625 mL di Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mL di SDS al 20% (p/v), 335 mL di soluzione di acrilammide/bisacrilammide al 30% (29:1), 12,5 mL di persolfato di ammonio al 10% p/v e 2,5 mL di TEMED. Rimuovere l'etanolo dai gel separatori e aggiungere la soluzione di gel di impilamento. Inserire un pettine con il numero di tasche desiderato senza introdurre bolle d'aria. Lasciare polimerizzare per 20-30 min.
Caricare 4 μL di ciascun campione e scala proteica in pozzetti separati ed eseguire il gel nel tampone di corsa Tris-Glycine (Tabella 1) a 144 V per 45 minuti a temperatura ambiente.
nota: Interrompere il gel quando la banda di bromofenolo sta per migrare fuori dal gel.
Colorare il/i gel/i in una soluzione Fairbanks A preriscaldata (Tabella 1) per 30 minuti su un bilanciere.
Decolorare il/i gel/i in una soluzione Fairbanks preriscaldata D (Tabella 1) fino allo sfondo desiderato (ad es. durante la notte) su un bilanciere.

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Risultati

soluzioni	Ricette
Buffer A	10 mM di fosfato di potassio (pH 6,5), 1 mM di EDTA
Buffer B	Tampone A contenente il 2% di Nonidet P-40. Può essere conservato a temperatura ambiente per un uso successivo.
Fairbanks A (Soluzione colorante)	25% isopropanolo, 10% acido acetico gla...