Elettroforesi su gel di poliacrilammide urea denaturante per l'analisi dell'RNA: una tecnica per separare gli oligonucleotidi di RNA fosforilati marcati in fluorescenza dai loro equivalenti non fosforilati

Abstract

Fonte: Pillon, M. C., et al., Saggio non radioattivo per misurare la fosforilazione polinucleotidica di substrati di piccoli nucleotidi. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo un'elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante per la separazione delle specie di RNA fosforilato dalle loro controparti non fosforilate. Le specie di RNA sono marcate in fluorescenza per il rilevamento laser sul gel.

Protocollo

1. Elettroforesi su gel

1. Preparare una soluzione di gel di acrilammide al 15%/8 M.
   cautela: L'acrilammide deve essere maneggiata con cura, perché è una neurotossina. Indossare sempre guanti, camice da laboratorio e occhiali protettivi quando lo si maneggia.
   1. In un becher di vetro da 150 mL, combinare 22,5 mL di soluzione premiscelata di acrilammide/bis-acrilammide 29:1 al 40%, 6 mL di 10x TBE, 28,8 g di urea e acqua priva di RNasi per un volume totale di 59 mL. Mescolare delicatamente la soluzione.
      nota: A seconda della lunghezza del substrato dell'RNA, l'alterazione della percentuale di poliacrilammide può migliorare la risoluzione tra RNA non fosforilato e fosforilato.
   2. Per sciogliere l'urea, scaldare la soluzione nel microonde per 20 s, mescolare il liquido e rimettere immediatamente la soluzione nel microonde per altri 20 s. Mescolare delicatamente la soluzione fino a quando l'urea non si scioglie completamente.
   3. Raffreddare lentamente la soluzione mettendo il bicchiere di vetro in un bagno d'acqua poco profonda contenente acqua fredda. Assicurarsi che il livello di acqua fredda che circonda il bicchiere di vetro sia superiore al livello della soluzione all'interno del bicchiere di vetro. Ciò promuoverà un efficiente trasferimento di calore. Attendere 5 min.
      nota: Non continuare con questo protocollo se il bicchiere di vetro è caldo; l'acqua deve essere inferiore a 25 °C. Se dopo 5 minuti fa ancora caldo, sostituire l'acqua del bagnomaria con acqua fresca fredda e attendere altri 5 minuti.
   4. Filtrare e degassare la soluzione utilizzando un'unità di filtrazione monouso da 0,22 μm per rimuovere il particolato e le bolle d'aria microscopiche.
2. Versare il gel denaturante
   1. Usa sapone e acqua tiepida per pulire una lastra di vetro corta e lunga progettata per gel con dimensioni complessive di 31,0 cm x 38,5 cm. Spruzza ogni lastra di vetro con etanolo al 95% e pulisci il vetro per rimuovere l'umidità.
      nota: Una delle due piastre può essere siliconata per evitare danni al gel durante la separazione del sandwich di lastre di vetro. Tuttavia, questo passaggio non è necessario perché questo protocollo è progettato per visualizzare l'RNA senza separare le lastre di vetro.
   2. Posizionare la lunga lastra di vetro orizzontalmente sopra una scatola in modo che sia sollevata dal piano di lavoro.
      cautela: L'acrilammide è tossica, quindi la stazione di colata del gel deve essere ricoperta da carta da banco in grado di assorbire qualsiasi liquido versato ed essere immediatamente collocata in un sacchetto per rifiuti al termine della procedura.
   3. Posizionare un distanziatore pulito da 0,4 mm lungo i bordi lunghi della lastra di vetro lunga.
   4. Appoggiare la lastra di vetro corta sopra la lastra lunga e assicurarsi che i bordi della lastra corta, della lastra lunga e dei distanziatori siano allineati. Bloccare ogni lato utilizzando tre morsetti metallici equidistanti.
   5. Aggiungere 24 μl di TEMED alla soluzione di acrilammide al 15%/urea 8 M preparata al punto 3.1 e mescolare la soluzione.
   6. Aggiungere 600 μl di APS al 10% (p/v) alla soluzione al punto 1.2.5 e mescolare delicatamente la soluzione.
   7. Versare immediatamente la soluzione tra le lastre di vetro.
      nota: Per evitare bolle, picchiettare il bicchiere mentre la soluzione viene versata.
   8. Aggiungere con cura un pettine pulito, da 0,4 mm, a 32 pozzetti sulla parte superiore del sandwich di lastra di vetro.
   9. Attendere un minimo di 30 minuti affinché l'acrilammide polimerizzi.
3. Esegui il gel denaturante
   1. Impostare il blocco termico a 75 °C.
   2. Rimuovere il metallo clamps che tengono insieme il sandwich della lastra di vetro e lavare e asciugare accuratamente il sandwich della lastra di vetro.
   3. Posizionare il sandwich di lastra di vetro nell'apparecchio in gel con la piastra corta rivolta verso l'interno.
   4. Preparare un tampone di corsa 0,5x TBE combinando 100 mL di 10x TBE con 1,9 L di acqua priva di RNasi. Aggiungere 600 mL di tampone di corsa nelle camere superiore e inferiore dell'apparato in gel.
   5. Rimuovere delicatamente il pettine e sciacquare accuratamente i pozzetti utilizzando una siringa. NOTA: Questo passaggio è fondamentale per rimuovere l'urea dai pozzetti.
   6. Pre-far funzionare il gel per 30 minuti a 50 W. La tensione è di circa 2.000 V. ATTENZIONE: Questo apparecchio in gel funziona ad alta potenzatage e gli utenti devono prestare attenzione.
   7. Sciacquare accuratamente i pozzetti con una siringa.
      nota: Questo passaggio è fondamentale per caricare uniformemente il campione nei pozzetti.
   8. Pulse spin le reazioni estinte. Quindi incubare le provette a 75 °C per 3 minuti. Ripeti la centrifuga del polso.
   9. Caricare immediatamente 10 μl di campione per pozzetto e far funzionare il gel per 3 ore a 50 W.
      nota: L'RNA marcato in fluorescenza è sensibile alla luce; Pertanto, coprire l'apparecchio in gel con un foglio.
4. Immaginate il gel denaturante.
   1. Spegnere l'alimentazione e svuotare la camera superiore dell'apparecchio in gel.
   2. Lavare e asciugare il lato esterno del sandwich di lastra di vetro con acqua e sapone. Coprire il sandwich di lastra di vetro con un foglio durante il trasporto del gel.
   3. Montare il sandwich di lastre di vetro sul tavolino di uno scanner laser in grado di rilevare la fluorescenza quantitativa e sensibile.
      nota: Questo gel è estremamente sottile per la massima risoluzione. Per questo motivo, questo protocollo è stato progettato per evitare le difficoltà di rimuovere il gel dal sandwich di lastre di vetro, visualizzando direttamente l'RNA marcato in fluorescenza attraverso le lastre di vetro. L'uso di lastre di vetro a bassa fluorescenza disponibili in commercio aumenterà il segnale catturato migliorando il rapporto segnale/rumore.
   4. Impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dello scanner laser per il fluoroforo desiderato.
      nota: Le lunghezze d'onda ottimali di eccitazione ed emissione possono differire per fluorofori specifici. Per il fluoroforo FAM, le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono rispettivamente di 495 nm e 535 nm.
   5. Definire l'area da visualizzare sul tavolino dello scanner laser e visualizzare il gel secondo le istruzioni del produttore (Figura 1).

Risultati

Figura 1: Esempio di analisi del gel denaturante dell'RNA fosforilato. Saggio in vitro dell'RNA chinasi di Las1-Grc3 (110 nM) incubato con 500 nM di RNA SC-ITS2. X segna la reazione di controllo senza Las1-Grc3 e il triangolo nero rappresent...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pettine a 34 pozzetti da 0,4 mm	BioRad	1653848
Distanziale da 0,4 mm	BioRad	1653812
0,5 M EDTA ph 8,0	KD Medico	RGF-3130
1M Cloruro di magnesio	KD Medico	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Medico	RGF-3360
Soluzione di acrilammide/bis al 40% 29:1	BioRad	1610146
5M Cloruro di sodio	KD Medico	RGF-3720
Persolfato di ammonio (APS)	BioRad	Codice 161-0700
ATP	sigma	Codice A2383-1G
acido borico	sigma	B0394
sale sodico blu di bromofenolo	sigma	B5525-5G
Lastre di vetro	Thomas Scientific	Codice 1188K51
Sequenziatore Hoefer SQ3	Hoefer	N/A
Immagine J Software	N/A	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
Oligonucleotidi a RNA marcati	IDT	Ordine personalizzato
Alimentatore Pharmacia EPS 3500	Farmaceutica	N/A
Filtro Steriflip 0. 22 um	Millipore	5FCP00525
TEMED	BioRad	Codice 161-0800
tris base	sigma	TRIS-RO
Imager su gel Typhoon FLA 9500	GE Sanità	N/A
Acqua DEPC ultra pura	Invitrogen	750023
Glicerolo ultra puro	Invitrogen	Codice 19E1056865
urea	Fisher Chemical	U15-500