Elettroforesi su gel di poliacrilammide urea denaturante per l'analisi dell'RNA: una tecnica per separare gli oligonucleotidi di RNA fosforilati marcati in fluorescenza dai loro equivalenti non fosforilati

Abstract

Fonte: Pillon, M. C., et al., Saggio non radioattivo per misurare la fosforilazione polinucleotidica di substrati di piccoli nucleotidi. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo un'elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante per la separazione delle specie di RNA fosforilato dalle loro controparti non fosforilate. Le specie di RNA sono marcate in fluorescenza per il rilevamento laser sul gel.

Protocollo

1. Elettroforesi su gel

1. Preparare una soluzione di gel di acrilammide al 15%/8 M.
   cautela: L'acrilammide deve essere maneggiata con cura, perché è una neurotossina. Indossare sempre guanti, camice da laboratorio e occhiali protettivi quando lo si maneggia.
   1. In un becher di vetro da 150 mL, combinare 22,5 mL di soluzione premiscelata di acrilammide/bis-acrilammide 29:1 al 40%, 6 mL di 10x TBE, 28,8 g di urea e acqua priva di RNasi per un volume totale di 59 mL. Mescolare delicatamente la soluzione.
      nota: A seconda della lunghezza del substrato dell'RNA, l'alterazione della percent....

Risultati

Figura 1: Esempio di analisi del gel denaturante dell'RNA fosforilato. Saggio in vitro dell'RNA chinasi di Las1-Grc3 (110 nM) incubato con 500 nM di RNA SC-ITS2. X segna la reazione di controllo senza Las1-Grc3 e il triangolo nero rappresent.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pettine a 34 pozzetti da 0,4 mm	BioRad	1653848
Distanziale da 0,4 mm	BioRad	1653812
0,5 M EDTA ph 8,0	KD Medico	RGF-3130
1M Cloruro di magnesio	KD Medico	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Medico	RGF-3360
Soluzione di acrilammide/bis al 40% 29:1	BioRad	1610146
5M Cloruro di sodio	KD Medico	RGF-3720
Persolfato di ammonio (APS)	BioRad	Codice 161-0700
ATP	sigma	Codice A2383-1G
acido borico	sigma	B0394
sale sodico blu di bromofenolo	sigma	B5525-5G
Lastre di vetro	Thomas Scientific	Codice 1188K51
Sequenziatore Hoefer SQ3	Hoefer	N/A
Immagine J Software	N/A	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
Oligonucleotidi a RNA marcati	IDT	Ordine personalizzato
Alimentatore Pharmacia EPS 3500	Farmaceutica	N/A
Filtro Steriflip 0. 22 um	Millipore	5FCP00525
TEMED	BioRad	Codice 161-0800
tris base	sigma	TRIS-RO
Imager su gel Typhoon FLA 9500	GE Sanità	N/A
Acqua DEPC ultra pura	Invitrogen	750023
Glicerolo ultra puro	Invitrogen	Codice 19E1056865
urea	Fisher Chemical	U15-500