Elettroforesi su gel di agarosio semi-denaturante bidimensionale: una tecnica per separare le fibre di amiloide polimorfiche in base all'eterogeneità dimensionale

Abstract

Fonte: Hanna-Addams, S., et al. Uso dell'elettroforesi bidimensionale del gel di agarosio detergente semi-denaturante per confermare l'eterogeneità dimensionale delle fibre amiloidi o amiloidi. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra la separazione bidimensionale semi-denaturante su gel di agarosio basata sull'elettroforesi delle fibre amiloidi. La tecnica separa gli aggregati polimorfici di amiloide in base alle loro dimensioni eterogenee.

Protocollo

1. Prepara i campioni

1. Coltura di 2 x 10⁶ cellule tumorali del colon HT-29 produttrici di amiloide in una piastra di coltura tissutale di 10 cm in 10 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 10% di siero fetale bovino e penicillina-streptomicina. Colture di cellule per una notte in un incubatore a 37 °C con CO₂ al 5%.
   1. Dopo che le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza, lavare le cellule con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere 3 mL di soluzione di Tripsina e incubare a 37 °C per 3 min.
   2. Dopo che le cellule sono completamente dissociate dal piatto, aggiungere 10 mL di terreno di coltura e trasferire le cellule con una pipetta da 10 mL in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le celle a 1.000 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il terreno, risospendere le cellule in 5 mL di terreno di coltura e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule. Piastra 2 x 10⁶ celle in ciascuna delle due piastre da 10 cm.
   3. Lasciare che le cellule aderiscano e si riprendano per una notte in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂. Applicare il trattamento su una piastra per indurre la formazione di amiloidi con 20 ng/mL di fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), 100 nM di Smac-mimetico e 20 μM di inibitore della pan-caspasi Z-VAD-FMK. La combinazione è abbreviata in TSZ. Trattare l'altro piatto con veicolo come controllo.
2. Dopo il periodo di tempo appropriato, di solito 6 ore, raccogliere il lisato cellulare.
   1. Raschiare le cellule dalla piastra con un raschietto di plastica e utilizzare una pipetta da 10 ml per trasferirle in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare le celle a 1.000 x g per 3 minuti a 4 °C.
   2. Lavare le cellule 2 volte risospendendole in 10 mL di PBS ghiacciato e centrifugando a 1.000 x g per 3 minuti a 4 °C. Aspirare la soluzione di PBS.
      nota: Il processo può essere messo in pausa congelando il pellet di cella in azoto liquido e conservandolo a ˗80 °C per un massimo di 1 mese.
   3. Trasferire il pellet cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e incubare in 0,3 mL di tampone di lisi per 30 minuti con ghiaccio. Centrifugare a 20.000 x g per 15 min a 4 °C. Il surnatante è il lisato dell'intera cellula.
      nota: Il processo può essere messo in pausa conservando il campione a -20 °C per un massimo di diversi mesi.
   4. Misurare la concentrazione proteica mediante un saggio di Bradford. Aggiungere 4 tamponi di caricamento SDD-AGE per preparare 20 μL di campione da 3 μg/μL e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.

2. Prepara ed esegui i gel

1. Aggiungere 2 g di agarosio a 200 ml di tampone 1x Tris-acetato (TAE) in un becher di vetro e scaldare in un forno a microonde per sciogliere l'agarosio. Aggiungere 1 mL di SDS al 20% per una concentrazione finale di SDS allo 0,1%. Agitare con cura per mescolare. Fare attenzione a non generare bolle dopo l'aggiunta della SDS.
2. Versare la soluzione di agarosio in una lastra di gel di 15 cm x 14 cm. Utilizzare una pipetta da 1 ml per eliminare eventuali bolle. Posiziona un pettine da 20 pozzetti in alto.
3. Prima dimensione: Pipettare 60 μg di lisato a cellule intere nella corsia all'estrema destra. Far funzionare il gel a 60 V per circa 4 ore (fino a quando il fronte del colorante si trova a circa 3/4 attraverso il gel) utilizzando il TAE contenente lo 0,1% di SDS come tampone di corsa.
4. Seconda dimensione: Ruotare con cautela il gel di 90° in senso antiorario (Figura 1A). Far funzionare il gel a 60 V per circa 4 h.
   nota: La condizione generale di funzionamento è di 4 V/cm di lunghezza del gel. È importante che le condizioni di funzionamento siano esattamente le stesse per la prima e la seconda dimensione.

Risultati

Figura 1. Protocollo sperimentale.(A) Schema dell'elettroforesi su gel di agarosio detergente semi-denaturante bidimensionale (2D SDD-AGE). Inizia caricando il campione nella corsia più a destra, etichettata in rosso. Al termine della prima corsa di quotatura, ruotare il gel di 90° in senso antiorario. Eseguire l'elettroforesi di seconda dimensione. La freccia continua indica la direzione della prima c...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
unità di elettroforesi su gel	pescatore	HE99XPRO	Appratus per la corsa in gel.
agrose	VWR	97062-250	Per gel di agarosio.
DMEM	sigma	D6429	per coltura cellulare
siero fetale bovino	sigma	F4135	per coltura cellulare
penicilina-streptomicina	sigma	P4333	per coltura cellulare
Soluzione di tripsina	sigma	T4049	per coltura cellulare
PBS per coltura tissutale	sigma	D8662	per coltura cellulare
TNF ricombinante	Realizzato nel nostro laboratorio		per indurre la necroptosi. Vedere il riferimento 11.
smac-mimetico	dono del Dr. Xiaodong Wang		per indurre la necroptosi. Vedere il riferimento 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	Anno 1902	per indurre la necroptosi. Vedere il riferimento 11.
Contatore di celle	Bio-Rad	1450102	Modello TC20; per il conteggio delle celle
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce™ BCA	Termo Scientifico	Codice 23225	per misurare la concentrazione di proteine nei lisati cellulari
Sollevatore di celle	pescatore	07-200-364	per rimuovere le cellule dal piatto
Tampone di lisi (1 l)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 ml di glicerolo 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL di Triton-X100 (inibitori della proteasi e dei fosfati a piacere)
10X TAE (1 L)			48,4 g Tris base 11,42 mL di acido acetico glaciale 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 fino a 1 L
4X tampone di caricamento SDD-AGE (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 ml di glicerolo 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% blu di bromofenolo 31 mL ddH2O
Tampone di lavaggio PBST (1 l)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 ml di Tween20
10X PBS (10 L)			800 g di NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 aggiungere ddH2Ø a 10 L