Multimer-PAGE per la separazione di complessi proteici nativi: una tecnica di separazione ibrida costituita da Blue Native-PAGE e SDS-PAGE per separare le proteine multimeriche intatte dal lisato tissutale

Abstract

Fonte: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: Un metodo per catturare e risolvere complessi proteici in campioni biologici. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video descrive la PAGINA multimerica per la separazione di complessi proteici nativi da omogeneizzati tissutali. La tecnica è un ibrido tra le tecniche blue native-PAGE e SDS-PAGE. I complessi separati possono essere caratterizzati e studiati per il loro ruolo nel funzionamento cellulare.

Protocol

1. Preparazione dei tessuti

1. Preparare 10 mL di tampone campione BN-PAGE 4x (200 mM di Bis(2-idrossietil)ammino-tris(idrossimetil)metano (Bis-Tris), 200 mM di NaCl, 40% p/v glicerolo, 0,004% Ponceau S, pH 7,2).
   nota: Questa soluzione madre può essere preparata in anticipo e conservata a 4 °C.
2. Diluire 250 μL di tampone campione 4x in 750 μL dH₂O contenente 1x cocktail di inibitori della proteasi commerciali. Vortice e rilassati sul ghiaccio.
3. Omogeneizzare 20 mg di tessuto bersaglio nel tampone campione BN-PAGE da 1 mL 1x ghiacciato con 30 colpi di omogeneizzatore clean dounce.
   nota: Per questo esperimento dimostrativo, il tessuto bersaglio è l'intero tessuto cerebrale di ratto. Dopo l'omogeneizzazione, i campioni possono essere trattati con un detergente delicato come la digitonina al 2% per solubilizzare e consentire l'elettroforesi delle proteine di membrana.
4. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 14.000 x g per 30 minuti fino a ottenere un contenuto cellulare insolubile in pellet. Dopo la centrifugazione, decantare il surnatante in una provetta pulita con ghiaccio.
5. Seguire le istruzioni del produttore per misurare la concentrazione di proteine surnatanti utilizzando l'acido bicinconninico (BCA) o un saggio di quantificazione proteica simile.
6. Se il campione o i campioni di omogeneizzato contengono detergente, aggiungere una quantità di Coomassie Blue G-250 al 5% in una soluzione acquosa sufficiente a portare la soluzione omogenata allo 0,25% di Coomassie.

2. BN-PAGINA

1. Diluire 25 mL di tampone per elettroforesi nativo blu (BN) 20x (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricina, pH 6,8) in 475 mL dH₂O contenente lo 0,002% di Coomassie Blue per ottenere 500 mL di tampone 1x in esecuzione.
   1. Se i campioni contengono detersivo, preparare invece 250 ml di tampone corrente 1x contenente lo 0,02% di Coomassie e altri 250 ml che non ne contengono nessuno.
2. Tampone/i di raffreddamento a 4 °C.
3. Pulire e assemblare una cassetta per versare gel di poliacrilammide secondo le istruzioni del produttore.
4. Versare il gel di poliacrilammide BN (3% strato di impilamento T, 6% strato di risoluzione T) secondo una ricetta standard e posizionare il pettine a pozzetto.
5. Dopo che i gel si sono polimerizzati, sciacquare la cassetta con dH₂O e assemblare l'apparecchio per elettroforesi secondo le istruzioni del produttore.
6. Rimuovere il pettine e riempire i pozzetti con 1x tampone di scorrimento BN-PAGE. Evitare di riempire l'intera camera interna con il tampone fino a quando i campioni non sono stati caricati.
   1. Se i campioni contengono detersivo, riempire i pozzetti con il tampone contenente lo 0,02% di Coomassie Blue.
      NOTA: Eseguire i passaggi 2.7-2.9 a 4 °C.
7. Utilizzando i puntali di caricamento del gel, pipettare un volume di omogenato contenente 20 μg di proteine nei pozzetti desiderati. Pipettare un volume equivalente di 1x tampone per campioni BN-PAGE in tutti i pozzetti inutilizzati.
   nota: Utilizzare la concentrazione proteica determinata dal saggio BCA per calcolare il volume appropriato dell'omogenato da aggiungere ai pozzetti.
8. Dopo aver caricato i campioni, riempire la camera interna con 1 tampone di corsa BN-PAGE. Assicurati che il gel sia completamente immerso nel tampone. Quindi, riempire la camera esterna con 1 tampone di marcia fino al livello indicato dal produttore.
   1. Se i campioni contengono detergente, riempire la camera interna con il tampone 1x contenente lo 0,02% di Coomassie Blue e la camera esterna con il tampone di scorrimento 1x senza coloranti.
9. Collegare gli elettrodi all'alimentatore ed elettroforare le proteine nel gel a 150 V fino a quando la banda del colorante progredisce di ~2 cm nello strato di risoluzione. Arrestare e scollegare l'alimentazione.

3. Reticolazione

NOTA: Esegui i passaggi 3.1-3.6 a 4 °C.

1. Smontare l'apparecchio per elettroforesi e separare le lastre di vetro della cassetta gel. Rimuovere ed eliminare lo strato di impilamento.
2. Taglia con cura il gel appena sotto il bordo inferiore della parte anteriore della tintura. Fai attenzione a rendere questo taglio il più liscio e dritto possibile, quindi scarta il pezzo di gel inutilizzato. Questo lascerà una striscia orizzontale larga ~2 cm di gel di poliacrilammide, che conterrà tutte le proteine nel campione di omogeneizzato.
3. Taglia via le parti inutilizzate lungo i bordi della striscia di gel.
4. Posizionare con cautela la striscia in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un piccolo contenitore e mescolare delicatamente con la nutazione per 30 minuti per equilibrare.
5. Dopo l'equilibratura, scartare e sostituire il PBS con altri 10 ml. Pipettare 500 μl di DSP da 25 mM disciolti in dimetilsolfossido nel PBS e continuare a miscelare come sopra (passaggio 3.4) per 30 minuti.
6. Versare la soluzione DSP. Aggiungere 10 mL di tris(idrossimetil)amminometano cloridrato 0,375 M (Tris-HCl), pH 8,8, contenente il 2% di sodio dodecil solfato (SDS) per estinguere il DSP non reagito. Continuare la nutazione per 15 min.

4. PAGINA SDS

1. Mentre la striscia di gel è in fase di tempra, preparare le soluzioni di gel SDS-PAGE secondo i metodi standard. Non aggiungere reagenti di polimerizzazione.
2. Dopo la tempra, riportare la striscia di gel ΒΝ a temperatura ambiente e gettare la striscia in una nuova cassetta di gel.
   1. Per fare ciò, raccogli con cura il gel e posizionalo su una piastra distanziatrice per cassetta gel pulita.
   2. Orientare la striscia in modo che la parte inferiore del fronte del colorante sia più vicina alla parte superiore di una nuova cassetta (ad esempio, il lato che ha viaggiato più lontano durante BN-PAGE dovrebbe essere il più vicino alla parte superiore della nuova cassetta; la striscia di gel dovrebbe essere capovolta rispetto al suo orientamento precedente). Vedere la Figura 1.
   3. Posizionare la striscia in modo che il suo bordo superiore si trovi allo stesso livello del punto in cui si troverà il bordo superiore della piastra di copertura (cioè, sarà nella parte superiore del nuovo gel). Assicurati che la parte anteriore del colorante sia parallela ai bordi orizzontali della lastra di vetro.
   4. Spingere un lato della striscia asportata contro una delle pareti del distanziatore, lasciando spazio sull'altro lato per il versamento del gel e il caricamento di uno standard proteico o di una scala.
   5. Se il bordo inferiore della striscia di gel contiene aree frastagliate o irregolari, tagliarle via con cura. Se presenti, intrappoleranno le bolle durante il versamento del gel.
   6. Una volta posizionata correttamente la striscia di gel, appoggiare la piastra di copertura sopra la piastra distanziatrice. Applicare una leggera pressione per espellere eventuali bolle d'aria intrappolate.
   7. Continuare a montare l'apparecchio per versare il gel secondo le istruzioni del produttore.
3. Aggiungere i reagenti di polimerizzazione al tampone gel risolutivo e versarlo nella cassetta di gel preparata, utilizzando una pipetta sierologica. Riempire la cassetta di gel fino a ~2 cm sotto la striscia di gel BN-PAGE asportata, per lasciare spazio allo strato di impilamento.
4. Aggiungere 100 μL di butanolo sopra il gel colato e attendere 30 minuti per la polimerizzazione dello strato risolutivo. Versare il butanolo.
5. Aggiungere i reagenti di polimerizzazione alla soluzione di gel di impilamento. Utilizzando una pipetta sierologica, versare lo strato di impilamento per riempire tutto lo spazio vuoto rimanente nella cassetta del gel.
   1. Inclinare la cassetta del gel mentre lo strato di impilamento viene versato in modo che riempia lo spazio sotto la striscia di gel e le bolle d'aria non rimangano intrappolate.
   2. Man mano che il tampone di gel impilabile riempie lo spazio vuoto sotto la striscia di gel, riportare gradualmente la cassetta del gel in piano.
   3. Continua a riempire lo spazio vuoto accanto alla striscia di gel asportata con il tampone di gel di impilamento, fino a quando non trabocca quasi.
6. Lasciare polimerizzare lo strato di impilamento per 30 min.
   nota: Preparare 10 tamponi di esecuzione SDS-PAGE (250 mM di tris(idrossimetil)amminometano (tris), 1,9 M di glicina, 1% di SDS) durante la polimerizzazione del gel. Questo può anche essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente.
7. Diluire 50 mL di tampone corrente 10x SDS-PAGE in 450 mL dH₂O per ottenere 1x tampone di lavoro.
8. Dopo che lo strato di impilamento si è polimerizzato, rimuovere la cassetta del gel dall'apparecchio di colata, sciacquare con dH₂O e assemblare l'apparecchio per elettroforesi secondo le istruzioni del produttore.
9. Riempire completamente la camera interna con 1x tampone di scorrimento SDS-PAGE, quindi riempire la camera esterna fino al livello indicato dal produttore.
10. Caricare lo spazio accanto alla striscia di gel asportata con una scala di peso molecolare o uno standard proteico appropriato.
11. Collegare gli elettrodi all'alimentatore ed elettroforizzare i campioni a 120 V. Quando il colorante Coomassie esaurisce il gel, arrestare e scollegare l'alimentazione.
12. Analizzare il gel utilizzando metodi standard di elettroblotting e rilevamento delle proteine mediante legame anticorpale.

Results

Figura 1: Diagramma di flusso generale del multimer-PAGE.
(A) Preparare il lisato tissutale utilizzando metodi non denaturanti, come l'omogeneizzazione nel tampone del campione BN-PAGE. (B) Pipettare il lisato nel gel BN-PAGE, quindi eseguire l'elettroforesi (150 volt) nel tampone di esecuzione BN-PAGE. Lasciare migrare il campione fino a quando il fronte del colorante non è migrat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
prodotti chimici
Acido ε-amminocaproico	sigma	Codice: A2504
acrilamide	Acros Organics	164855000	Tossico.
Acrilammide/bisacrilamide 37,5:1 (soluzione madre al 40%T)	BioRad	Codice 161-0148	Tossico.
Persolfato di ammonio	sigma	Trasmissione A3678
Anti coniglio IgG-HRP da capra	Santa Cruz Biotecnologia	SC-2004
Kit di test dell'acido bicinconnico	Thermofisher	Codice 23225
Bis-tris	sigma	B9754
Albumina sierica bovina	sigma	Codice: A9647
butanolo	Fisher Scientifico	A399-1
Kit substrato a chemiluminescenza	ThermoFisher	Codice 24078
Blu Coomassie G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonina	sigma	D141	Tossico.
Dimetilsolfossido	Fisher Scientifico	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionato)	Termo Scientifico	Codice 22585
Latte scremato in polvere	Laboratorio Scientifico	Codice: M0841
glicerolo	sigma	G9012
glicina	Fisher Scientifico	BP381-5
Cocktail di inibitori della proteasi Halt	Thermofisher	Codice: 78430
acido cloridrico	Fisher Scientifico	A144SI-212	Per la titolazione. Caustico.
metanolo	Fisher Scientifico	Pannello A412-4	Per l'attivazione della membrana PVDF. Tossico.
Monoclonale anti α-sinucleina IgG da coniglio	Santa Cruz Biotecnologia	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina	sigma	T9281
N,N'-metilenbisacrilammide	Acros Organics	Codice: 16479	Tossico.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polisorbato 20 (interpolazione-20)	Fisher Scientifico	BP337-500
Membrane di trasferimento di fluoruro di polivinilidene	Termo Scientifico	Codice 88518
Ponceau S	sigma	P3504
cloruro di potassio	Fisher Scientifico	P217-3
Fosfato di potassio monobasico	sigma	P9791
Cocktail di inibitori della proteasi	Termo Scientifico	Codice 88265
Soluzione SDS (10% p/v)	BioRad	Codice 161-0416
cloruro di sodio	Fisher Scientifico	BP358-212
Sodio dodecil solfato	sigma	L37771
Sodio fosfato monobasico	Fisher Scientifico	BP329-1
Tricine	sigma	T0377
Base tris	Fisher Scientifico	BP152-500
Tris-HCl (tampone 0,5 M, pH 6,8)	BioRad	Codice 161-0799
Tris-HCl (tampone 1,5 M, pH 8,8)	BioRad	Codice 161-0798
strumenti
GE Imagequant LAS 4000	GE Sanità	Codice 28-9558-10
Software ImageJ NIH
Lettore di micropiastre Synergy H1	BioTek
Formatore di gel + supporto	Biorad
Centrifuga Microfuge 22R	Beckman Coulter
Omogeneizzatore a dounce da 2 ml
Miscelatore a vortice	Fisher Scientifico
Omogeneizzatore tissutale ad ultrasuoni	Fisher Scientifico	FB120220