Elettroforesi su gel di agarosio di ampliconi di DNA post PCR: un metodo per analizzare i prodotti della PCR multiplex e valutare il successo della reazione PCR

In questo articolo

Abstract

Fonte: Gulla, S. et al. Analisi Tandem-repeat a numero variabile multi-locus del batterio patogeno per pesci Yersinia ruckeri mediante PCR multiplex ed elettroforesi capillare. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, dimostriamo la separazione del DNA batterico amplificato con PCR utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio. Il gel di agarosio funziona come un setaccio molecolare, consentendo al DNA caricato negativamente di migrare in base alle loro dimensioni sotto un campo elettrico applicato.

Protocollo

1. Conferma dell'amplicone PCR mediante elettroforesi su gel

Secondo le raccomandazioni del produttore, preparare un volume di gel di agarosio all'1,5% (p/v) in 1 tampone tris-borato-EDTA (TBE) appropriato per il numero di reazioni PCR da testare. Prima della fusione, aggiungere 5 μl di colorante fluorescente per acidi nucleici per 50 μl di soluzione di gel e mescolare. Utilizzare vassoi e pettini appropriati per la colata, lasciando un numero adeguato di pozzetti liberi per le scale di riferimento del DNA.
Dopo l'indurimento, immergere il gel in 1x tampone TBE in un sistema GE. Miscelare 5 μL di prodotto PCR insieme a 2 μL di colorante di caricamento e trasferire nei pozzetti del gel. Aggiungere 5 μL di scala di DNA in pozzetti vuoti come riferimento.
Far scorrere il gel a 110 V per 15 cm per circa 1 ora e utilizzare un sistema di imaging/visualizzazione su gel basato su UV per verificare la presenza di più bande (fino a cinque) che rappresentano gli ampliconi della PCR (vedere l'esempio nella Figura 1). Scartare il gel. Conservare i prodotti PCR rimanenti a 4 °C fino a nuova lavorazione.

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Risultati

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Figura 1: Elettroforesi su gel che verifica la presenza di più prodotti PCR. L'immagine conferma la presenza di più ampliconi PCR in tutte le 12 corsie contenenti campioni, con la prima corsia che rappresenta la scala del DNA utilizzata. Sono state indicate le dimensioni dei frammenti di scala selezionati, così come il test PCR e l'affiliazione al ceppo di ciascuna corsia.