Elettroforesi capillare: una tecnica per analizzare gli ampliconi di reazione a catena della polimerasi marcati in fluorescenza

Abstract

Fonte: Gulla, S. et al., Analisi Tandem-repeat a numero variabile multi-locus del batterio patogeno per pesci Yersinia ruckeri mediante PCR multiplex ed elettroforesi capillare. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video descrive la tecnica dell'elettroforesi capillare per analizzare gli ampliconi PCR marcati in fluorescenza ottenuti da vari campioni in base alle loro dimensioni. Genera un modello migratorio che determina le lunghezze delle coppie di basi dei frammenti con l'aiuto del colorante fluorescente marcato in ciascun frammento.

Protocollo

1. Configurazione e condizioni di funzionamento dell'elettroforesi capillare

1. Dopo la conferma degli ampliconi per PCR, diluire i prodotti per PCR 1:10 (v/v) in acqua purificata. Sigillare, mescolare e centrifugare brevemente.
2. Lavorando in una cappa aspirante, preparare un volume di master mix composto da 9 μL di formammide e 0,5 μL di dimensione standard per prodotto PCR (consentire il 10% di volume in eccesso). Agitare brevemente e distribuire 9,5 μl in pozzetti su una piastra appropriata per il sistema CE disponibile prima di aggiungere 0,5 μl di prodotto PCR diluito. Sigillare, mescolare e centrifugare brevemente.
   ATTENZIONE: Maneggiare con cura. Mescolando la formamide con l'acqua si genera acido formico, che è tossico.
3. Utilizzando un termociclatore PCR, denaturare i campioni a 95 °C per 3 minuti prima di raffreddarli a 4 °C all'infinito. Centrifugare brevemente e caricare la piastra su un sistema CE calibrato secondo le istruzioni del produttore.
4. Eseguire l'analisi CE dei frammenti utilizzando i reagenti appropriati per l'apparecchiatura scelta e le seguenti impostazioni: 60 °C; iniezioni di 5 s a 1,6 kV (32 V per cm); 32 minuti di esecuzione a 15 kV (300 V per cm). L'analisi dei frammenti CE di 24 pozzetti su un capillare 24 (50 cm) richiede in genere circa 50 minuti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Analizzatore genetico Avant 3500xL	Thermo Fisher Scientifico	Codice A30469	Utilizzato per l'analisi dei frammenti per elettroforesi capillare.
GelRed Colorante di acido nucleico, 10.000 volte in acqua	Biozio	Numero 41003	Colorante fluorescente per acidi nucleici utilizzato durante l'elettroforesi su gel.
GeneMapper Software 5	Thermo Fisher Scientifico	4475073	Utilizzato per la lettura di elettroferogrammi da elettroforesi capillare.
Colorante GeneScan 600 LIZ Taglia Standard v2.0	Thermo Fisher Scientifico	4408399	Dimensione standard utilizzata durante l'elettroforesi capillare.
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientifico	4311320/4440753	Formammide deionizzata utilizzata durante l'elettroforesi capillare. Preparare gli aliquout funzionanti.
Milli-Q acqua	Na	Na	Acqua purificata utilizzata durante la PCR e l'elettroforesi capillare. Ricetta standard; prodotto internamente.
Polimero POP-7 per analizzatori genetici 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Scientifico	A26077/4393713/4393709	Matrice di separazione utilizzata durante l'elettroforesi capillare.
Sistema di imaging/visualizzazione su gel basato su UV	Come preferito.	Na
Vortice	Come preferito.	Na