Elettroforesi su gel alcalino a cellula singola: una tecnica sensibile per la stima quantitativa del danno al DNA in singole cellule tumorali dopo la chemioterapia

Abstract

Fonte: Lu, Y., et al. Valutazione del danno al DNA in vitro utilizzando il saggio della cometa J. Vis. Exp. (2017)

In questo video, dimostriamo un saggio di elettroforesi alcalina a singola cellula per quantificare le rotture del DNA a singolo e doppio filamento nelle cellule trattate con doxorubicina. Le condizioni alcaline interrompono i legami idrogeno tra le coppie di basi del DNA, con conseguente completo svolgimento e separazione dei filamenti di DNA. Ciò consente la migrazione differenziale di frammenti di DNA integri e danneggiati in gel di agarosio dopo elettroforesi, rivelando una struttura a forma di cometa di DNA non danneggiato che migra lentamente formando la testa circolare della cometa e frammenti di DNA danneggiati che migrano rapidamente formando la coda allungata della cometa.

Protocol

1. Prepara i reagenti

1. 1x PBS
   1. Diluire 100 mL 10x PBS con 900 mL dH₂O e regolare il pH a 7,4 utilizzando un pHmetro. Conservare a temperatura ambiente.
2. Soluzione di lisi (LS)
   1. Preparare 2,5 mM di NaCl, 100 mM di EDTA disodico, 10 mM di base Tris e 200 mM di NaOH in 900 mL di dH₂O; in genere sono necessari circa 20 minuti per consentire alla miscela di dissolversi completamente. Regolare il pH a 10 utilizzando un pHmetro. Aggiungere l'1% di laurilsarosinato di sodio e l'1% di Triton X-100 e regolare il volume finale a 1.000 ml. Raffreddare a 4°C per almeno 30 minuti prima dell'uso.
3. Soluzione alcalina per elettroforesi (AES), pH >13
   1. Preparare 200 mM di NaOH e 1 mM di EDTA disodico in 800 mL dH₂O. Regolare il pH e assicurarsi che sia pH >13. Regolare il volume finale a 1.000 ml. Preparare fresco prima dell'uso e raffreddare a 4°C per almeno 30 minuti prima dell'uso
4. Soluzione colorante
   1. 1. Aggiungere 1 μL di colorante di acido nucleico fluorescente verde 10.000x (ad es. SYBR Green) in 30 mL di tampone Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA disodico, pH 7,4) e conservare a 4°C. Proteggere dalla luce.
5. 1% di agarosio a basso punto di fusione
   1. Fondere l'agarosio a basso punto di fusione all'1% (1 g in 100 mL dH₂O) in un forno a microonde. Agitare l'agarosio ogni 15-20 s per assicurarsi che l'agarosio sia completamente fuso. Mettere l'agarosio a bagnomaria a 37°C per almeno 20 minuti prima dell'uso.
6. Puntali per pipette pre-riscaldati
   1. Tagliare le estremità strette dei puntali per pipette P200 di 3 mm e scaldare a 37 °C prima di pipettare l'agarosio.

2. Prepara le diapositive delle comete

1. Rivestimento di vetrini
   1. Sciogliere l'agarosio all'1% (1 g in 100 mL dH₂O) in un forno a microonde per 2 - 3 minuti o fino a quando l'agarosio non è completamente fuso. Immergere i vetrini del microscopio nell'agarosio e pulire un lato del vetrino con un panno privo di lanugine.
   2. Appoggiare i vetrini su una superficie piana per asciugarli all'aria o riscaldarli a 50°C per un'asciugatura più rapida; dopo l'asciugatura deve formarsi un film di agarosio trasparente. Posizionare i vetrini rivestiti a 37°C prima dell'uso.
2. Preparazione di sospensioni a cellula singola
   1. Coltura e trattamento della cellula di glioma
      1. Coltura delle cellule U251 MG in terreno DMEM-Ham F-12 integrato con il 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina e 10 μg/mL di streptomicina a 37°C con il 5% di CO₂.
      2. Digerire le cellule utilizzando 1 mL di tripsina per 3 minuti e neutralizzare la tripsina utilizzando il terreno DMEM-Ham F-12 con FBS. Raccogliere in una provetta da 15 mL, centrifugare a 300 x g per 4 minuti, aspirare il terreno e sospendere le cellule a 2 x 10⁵ cellule/mL in 1x PBS.
         nota: Il campione di cellule deve essere preparato immediatamente prima di iniziare il test e tutti i campioni devono essere maneggiati in un ambiente buio o oscurato per evitare danni al DNA causati dalla luce.
      3. Combinare la sospensione cellulare con agarosio fuso all'1% a basso punto di fusione (a 37 °C) in un rapporto di 1:10 (v/v), miscelare delicatamente pipettando su e giù e pipettare immediatamente 30 μl su un vetrino rivestito di agarosio. Utilizzare il lato del puntale della pipetta per distribuire la miscela agarosio/cellule per garantire la formazione di uno strato sottile.
      4. Posizionare il vetrino in piano a 4°C al buio per 10 minuti. Aumentando il tempo di gelificazione a 30 minuti, si migliora l'aderenza dei campioni in ambienti ad alta umidità.
      5. Immergere il vetrino a 4°C LS al buio per 1 ora o tutta la notte.
3. Elettroforesi a singola cellula
   1. Per il saggio delle comete alcaline
      1. Rimuovere delicatamente i vetrini dall'LS, drenare il tampone in eccesso e immergerlo delicatamente in AES per 1 ora a 4°C per consentire lo svolgimento del DNA. Mantieni le diapositive al buio.
      2. Aggiungere AES pre-raffreddato nel vassoio per vetrini per elettroforesi, non superare 0,5 cm sopra i vetrini (questo dipende dalle dimensioni delle unità di elettroforesi), posizionare i vetrini all'interno e coprire con un tappo. Impostare la tensione di alimentazione su 1 V/cm (la lunghezza tra gli elettrodi) e far funzionare per 30 minuti a 4°C.
      3. Drenare la soluzione di elettroforesi in eccesso dal vetrino. Immergere delicatamente i vetrini due volte in dH₂O per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
      4. Immergere delicatamente i vetrini in etanolo al 70% per 5 minuti a temperatura ambiente. Procedere alla colorazione.
4. Macchia Cometa Diapositive
   1. Scivoli asciutti a 37°C per 10 - 15 minuti al buio.
   2. Mettere 50 - 100 μl di soluzione colorante di acido nucleico fluorescente verde su ogni agarosio essiccato e colorare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
   3. Sciacquare brevemente i vetrini in dH₂O e asciugarli completamente al buio a 37°C. Procedere all'acquisizione e all'analisi delle immagini.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS (Ca++, Mg++ gratuito)	TEKnova	P0196
NaCl	sigma	S5886
Edta	TEKnova	E0308
Base Trizma	sigma	T1503
NaOH	sigma	Codice: 72068
Sodio lauril sarcosinato	sigma	L7414
Triton X-100	sigma	Codice 93443
SYBR Verde	Invitrogen	S33102
Basso punto di fusione agarosio	Invitrogen	Codice: 16520
agarosio	Invitrogen	Ore 16500
95% etanolo	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
tripsina	GIBCO	Codice 25300-054
Vetrini in tessuto di vetro	SCIENZE DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA	Codice 63422-11
Salviette Kimwipes	KIMberly-Clark
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Denville
Puntali per pipette	Affilato
microonde	Avanti
Bagno d'acqua	precisione
Camera di elettroforesi orizzontale	TREVIGEN	Cometassay ES II
alimentatore	Bio-Rad
incubatrice	Laboratorio Quincy	Modello 12-140E
Microscopio a fluorescenza	Zeiss	Pannello LSM700
Micropipettatore	Eppendorf