Elettroforesi capillare microfluidica per il dimensionamento dei frammenti dei prodotti PCR: una tecnica di separazione elettroforetica basata su microchip per separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni

Abstract

Fonte: Wang, H., Zhu et al. Un robusto test basato sulla reazione a catena della polimerasi per quantificare le ripetizioni di trinucleotidi citosina-guanina-guanina nel gene del ritardo mentale-1 dell'X fragile. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive la tecnica di elettroforesi capillare microfluidica per separare gli ampliconi PCR in base alle loro dimensioni. Questa tecnica aiuta nel dimensionamento dei frammenti utilizzando coloranti fluorescenti e marcatori di dimensioni molecolari standard.

Protocollo

1. Dimensionamento dei frammenti dei prodotti PCR

1. Prima di iniziare, lasciare che il concentrato di colorante di DNA, la matrice di gel di DNA, il marcatore di DNA, la scala di DNA e i campioni di DNA purificato si equilibrino a temperatura ambiente per 30 minuti.
2. Impostazione della stazione di adescamento
   1. Sostituire la siringa (vedere Tabella dei materiali) quando si utilizza un nuovo lotto di reagenti.
   2. Regolare la piastra di base, rilasciare la leva della clip della siringa e farla scorrere verso l'alto fino alla posizione più alta.
3. Avviare il software di dimensionamento (vedere la tabella dei materiali) e preparare la miscela gel-colorante.
4. Concentrato di colorante a vortice per 10 s e centrifuga. Aggiungere 25 μl di colorante in una fiala di matrice in gel. Agitare bene la soluzione miscelata e centrifugare.
   1. Trasferire la miscela di colorante gel in un filtro rotante. Mettere il filtro centrifugo in una microcentrifuga e centrifugare per 10 minuti a temperatura ambiente a 1.500 x g ± 20%.
      NOTA: Proteggere la soluzione con il colorante dalla luce e conservare a 4 °C dopo l'uso. La miscela gel-colorante può essere utilizzata per circa 15 patatine una volta preparata. Lasciare che la miscela di colorante gel si equilibri a temperatura ambiente per 30 minuti ogni volta prima dell'uso.
5. Carica la miscela gel-colorante
   1. Inserire un nuovo chip DNA sulla stazione di adescamento. Aggiungere 9 μl di miscela gel-colorante nel pozzetto contrassegnato con "G". Assicurarsi che lo stantuffo sia posizionato in corrispondenza del segno di 1 mL e quindi chiudere la stazione di adescamento.
   2. Premere lo stantuffo della siringa verso il basso finché non viene trattenuto dalla clip. Attendere esattamente 30 secondi, quindi rilasciare la clip. Attendere 5 s, quindi tirare lentamente lo stantuffo nella posizione di 1 ml.
   3. Aprire la stazione di adescamento e aggiungere 9 μL di miscela gel-colorante nei pozzetti contrassegnati con "G".
6. Aggiungere 5 μL di marcatore nel pozzetto contrassegnato con il simbolo della scala e aggiungere anche 5 μL di marcatore in ciascuno dei 12 pozzetti del campione. Non lasciare i pozzetti vuoti.
7. Aggiungere 1 μL di scala di DNA nel pozzetto contrassegnato con il simbolo della scala. Aggiungere 1 μL di prodotto PCR (pozzetti usati) o 1 μL di acqua ultrapura (pozzetti non utilizzati) in ciascuno dei 12 pozzetti del campione. Mettere il chip orizzontalmente nell'adattatore del miscelatore a vortice e vorticare per 1 minuto all'impostazione indicata (2.400 giri/min).
8. Inserire il chip nello strumento bioanalizzatore ed eseguire il chip nello strumento entro 5 minuti.
9. Al termine del test, rimuovere immediatamente il chip usato dallo strumento.
10. Aggiungere lentamente 350 μL di acqua deionizzata in uno dei pozzetti del pulitore per elettrodi. Aprire il coperchio del bioanalizzatore e inserire il detergente per elettrodi. Chiudere il coperchio e incubare per circa 10 s. Aprire il coperchio e rimuovere il pulitore per elettrodi. Attendere altri 10 s per consentire all'acqua sugli elettrodi di evaporare e quindi chiudere il coperchio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumento bioanalizzatore Agilent 2100: provette PCR da 0,2 mL	Axygen	PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x tampone TE, pH 8.0, senza RNASI	Ambion	AM9849
Strumento bioanalizzatore Agilent 2100: Strumento bioanalizzatore 2100	Agilent	G2939AA
Strumento bioanalizzatore Agilent 2100: piastra PCR a 96 pozzetti	Thermo Fisher	AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Cartuccia per elettrodi	Agilent		Fornisce l'attrezzatura dello strumento 2100 Bioanalyzer
Strumento bioanalizzatore Agilent 2100: miscelatore a vortice IKA	Agilent		Fornisce l'attrezzatura dello strumento 2100 Bioanalyzer
Strumento bioanalizzatore Agilent 2100: Software di dimensionamento Software 2100 Expert	Agilent		Fornisce l'attrezzatura dello strumento 2100 Bioanalyzer
Strumento bioanalizzatore Agilent 2100: chip di test	Agilent		Fornisce l'attrezzatura dello strumento 2100 Bioanalyzer
Kit Agilent DNA 7500	Agilent	Codice: 5067-1506	Per il ridimensionamento dei frammenti
Kit Agilent DNA 7500: Scala DNA 7500 (tappo giallo)	Agilent		In kit: kit Agilent DNA 7500 (numero di catalogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Marcatori DNA 7500 (tappo verde)	Agilent		In kit: kit Agilent DNA 7500 (numero di catalogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: chip di DNA	Agilent		In kit: kit Agilent DNA 7500 (numero di catalogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Concentrato di colorante DNA (tappo blu)	Agilent		In kit: kit Agilent DNA 7500 (numero di catalogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Fiala DNA Gel Matrix (tappo rosso)	Agilent		In kit: kit Agilent DNA 7500 (numero di catalogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Pulitore per elettrodi	Agilent		In kit: kit Agilent DNA 7500 (numero di catalogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Filtro rotante	Agilent		Forniture del kit Agilent DNA 7500 (numero di catalogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Siringa	Agilent		Forniture del kit Agilent DNA 7500 (numero di catalogo: 5067-1506)
Stazione di adescamento trucioli	Agilent	Codice 5065-4401	Fornisce l'attrezzatura dello strumento 2100 Bioanalyzer
Collettore per vuoto a piastra filtrante: Collettore per vuoto MultiScreenHTS	Merck Millipore	MSVMHTS00	Strumento per vuoto per collettore sottovuoto a piastra filtrante per la purificazione di prodotti PCR
Piastra filtrante sottovuoto Colletto: Tappo in silicone	Merck Millipore	XX2004718	Collettore sottovuoto a piastra filtrante
Piastra filtrante per vuoto Colletto: Pompa per vuoto	Merck Millipore	WP6122050	Collettore sottovuoto a piastra filtrante
Piatto filtrante sottovuoto Colletto: Recipiente di raccolta rifiuti	Merck Millipore	XX1004705	Collettore sottovuoto a piastra filtrante