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1. Bloccare i residui liberi di cisteina usando la iodoacetammide
- Far crescere le cellule U-2 OS in un piatto di 6cm2 al 50%-60% di confluenza in un terreno essenziale minimo con glucosio alto contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di piruvato di sodio a 37 °C in 5% di CO2.
- Preparare una nuova scorta di 10 mM di iodoacetamide appena prima dell'uso, quindi scartare il reagente inutilizzato.
- Aggiungere 0,1 mM di iodoacetamide alla concentrazione finale direttamente al terreno di coltura cellulare. Scuotere delicatamente il piatto a temperatura ambiente per 2 minuti.
2. Raccolta delle cellule
- Aspirare il terreno dalle cellule.
- Lavare le cellule con 5 mL di soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) tre volte. Aspirare la soluzione di lavaggio finale di PBS, quindi aggiungere 1 mL di PBS freddo.
- Raschiare le cellule dal fondo del piatto usando un raschietto per cellule. Utilizzando una pipetta da 1 mL, aspirare il PBS e la sospensione cellulare ed erogare tutto il liquido in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare le celle a 7.500 x g per tre minuti a 4 °C. Aspirare il PBS, lasciando il pellet della cella. Il pellet di cella può essere conservato a -80 °C fino alla lavorazione
3. Estrazione di proteine
- Preparare 100 μl di un tampone di lisi 1x diluito in ddH2O (vedere la tabella dei materiali). Aggiungere il fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF) immediatamente prima dell'uso a una concentrazione finale di 1 mM.
- Aggiungere 50 μl del tampone di lisi 1x direttamente al pellet cellulare e sospendere. Incubare il prodotto con ghiaccio per 5 minuti.
- Sonicare per 8 s utilizzando la modalità a impulsi costanti al 40% (vedere la tabella dei materiali per il sonicatore; regolare secondo necessità per i diversi sonicatori), mantenendo l'estratto sul ghiaccio.
- Centrifugare l'estratto a 4 °C per 5 minuti a 16.000 x g. Il surnatante è la frazione proteica solubile. L'analisi di Bradford può essere eseguita per determinare la concentrazione proteica, se lo si desidera.
4. Preparazione del campione
- Prelevare 10 μL di estratto proteico solubile e aggiungere 10 μL di un tampone campione di Laemmli SDS 1x (4% SDS, 20% glicerolo, 0,004% blu di bromofenolo e 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Non aggiungere reagenti riducenti.
- Conservare i campioni in ghiaccio se il giorno stesso verrà eseguita l'analisi SDS PAGE; per la conservazione a lungo termine, -20 °C è appropriato. Poco prima di far funzionare il gel, riscaldare il campione per 5 minuti a 85 °C.
5. Reticolazione in vivo della formaldeide di proteine endogene in cellule OS U-2
- Coltiva le cellule OS U-2 in un pallone da 175 cm2 con una confluenza del 70%-80%.
- Eseguire la reazione di reticolazione della formaldeide
- In una cappa aspirante, aliquotare una soluzione di formaldeide al 37% acquistata da fonti commerciali. Aggiungere il fissativo della formaldeide direttamente al terreno fino a una concentrazione finale dell'1% e incubare a temperatura ambiente agitando delicatamente per 15 minuti.
- Per estinguere la reazione, aggiungere 1,25 M di glicina a una concentrazione finale di 0,125 M e incubare a temperatura ambiente agitando delicatamente su un bilanciere per 5 minuti.
- Lavare le cellule con 5 ml di PBS freddo tre volte. Aspirare la soluzione di lavaggio finale di PBS e aggiungere 10 ml di PBS. Raschiare le celle dal fondo del pallone usando un raschietto per cellule.
- Utilizzando una pipetta da 10 mL, aspirare il PBS e la sospensione cellulare ed erogare l'intero liquido in una provetta da centrifuga conica da 15 mL. Centrifugare le celle a 500 x g per 2 minuti a 4 °C. Aspirare il PBS, lasciando il pellet di cella.
6. Frazionamento dei nuclei
- Preparare 10 mL di tampone di omogeneizzazione: 0,25 M di saccarosio, 1 mM di EDTA, 10 mM di HEPES e 0,5% di BSA a pH 7,4. Aggiungere PMSF immediatamente prima dell'uso a una concentrazione finale di 1 mM e 3 mL di tampone di sospensione dei nuclei (0,1% Triton X-100 in PBS).
- Aggiungere 5 mL di tampone di omogeneizzazione direttamente al pellet cellulare e sospendere completamente. Centrifugare la sospensione a 500 x g per 2 minuti a 4 °C, quindi eliminare il surnatante.
- Sospendere il pellet in 5 mL di tampone di omogeneizzazione. Utilizzare un omogeneizzatore in vetro-teflon a tenuta stagna, omogeneizzare le celle a 10 colpi/500 giri/min.
- Centrifugare la sospensione a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C, quindi eliminare il surnatante.
NOTA: Utilizzare il surnatante per l'isolamento dei mitocondri centrifugando a 10.000 x g per 10 minuti.
- Sospendere il pellet in 1 mL di tampone di sospensione per nuclei e incubare su ghiaccio per 10 minuti.
- Centrifugare a 600 x g per 10 min. Scartare il surnatante.
- Sospendere il pellet in 1 mL di tampone di sospensione dei nuclei e centrifugare nuovamente. Scartare il surnatante. Il pellet finale sarà costituito da nuclei isolati.
7. Estrazione di proteine
- Ripetere la sezione 4, ad eccezione dell'aggiunta di 25 μl del tampone di lisi 1x direttamente al pellet della cella e della sospensione.
8. Preparazione del campione
- Preparare due campioni per SDS-PAGE prelevando 10 μl di estratto proteico solubile e aggiungere 10 μl di tampone per campioni SDS 2x Laemmli e 1 μl di 2-mercaptoetanolo (BME).
- Riscaldare un campione per 5 minuti a 37 °C e il secondo campione per 15 minuti a 98 °C per invertire il reticolo della formaldeide.
9. Analisi SDS-PAGE
- Preparare 1 litro di 1x tampone di corsa tris-glicina (25 mM Tris, 192 mM di glicina, 0,1% (p/v) SDS).
- Configurare l'apparato di funzionamento SDS-PAGE.
NOTA: questo protocollo utilizza una pagina TGX SDS prefabbricata al 16%. Da notare che è possibile utilizzare qualsiasi percentuale di gel.
- Secondo il protocollo del produttore, aprire la confezione in cui è conservato il gel e rimuovere la cassetta.
- Rimuovere il pettine che riveste i pozzetti e il nastro adesivo dalla parte inferiore della cassetta.
- Metti il gel nell'apparecchio da corsa.
- Riempire la camera con il tampone di corsa 1x fino a quando i pozzetti non sono immersi nel liquido. Utilizzando una pipetta di plastica, sciacquare i pozzetti con il tampone di scorrimento.
- Caricare i campioni sul gel insieme al marcatore standard prestained da 10 μl.
- Far scorrere il gel a 200 V fino a quando il fronte del colorante si trova a circa 1 cm dal fondo del gel.