Focalizzazione isoelettrica in fase liquida: una tecnica di elettroforesi per separare le molecole bioattive dall'estratto grezzo di Gymnema sylvestre

Abstract

Fonte: Veerapandian, R., et al. Separazione di piccole molecole bioattive, peptidi da fonti naturali e proteine da microbi mediante il metodo della focalizzazione isoelettrica preparativa (IEF). J. Vis. Exp. (2020).

Questo video descrive una tecnica per separare molecole complesse da estratti vegetali utilizzando la focalizzazione isoelettrica in fase liquida. Questa tecnica aiuta a purificare biomolecole complesse nel loro stato nativo che possono essere utilizzate per varie applicazioni a valle.

Protocollo

1. Separazione e purificazione di piccole molecole e peptidi dall'estratto di Gymnema sylvestre

1. Misurare 0,6 g di estratto vegetale e sciogliere in acqua distillata (60 mL) mescolando in una provetta a rullo per 5 min.
   NOTA: Qualsiasi campione biologico solubile e privo di sale può essere utilizzato per la separazione e la purificazione utilizzando uno strumento di focalizzazione isoelettrica (IEF) in fase liquida. I campioni con concentrazione di sale tampone fino a 10 mM possono essere utilizzati con una risoluzione leggermente ridotta.
2. Centrifugare l'estratto vegetale solubilizzato a 10.000 x g per 5 minuti per rimuovere le particelle insolubili.
3. Trasferire il surnatante (~60 mL) in una provetta da centrifuga da 80 mL e mescolarlo con 0,6 mL di anfolita (pH 3-10) all'1% (v/v).
4. Preparare l'unità IEF in fase liquida.
   1. Assemblare gli elettrodi IEF in fase liquida (pulsante anodo-rosso e pulsante catodo-nero) con le rispettive membrane di scambio secondo il manuale di istruzioni (Tabella dei materiali). Equilibrare le membrane a scambio anionico con 0,1 M di NaOH e le membrane a scambio cationico con 0,1 M H₃PO₄ almeno per 16 ore quando si utilizzano nuove membrane.
   2. Conservare le membrane in elettroliti (0,1 M NaOH o 0,1 M H₃PO₄) tra una corsa e l'altra e non lasciarle asciugare.
   3. Assemblare la parte interna ed esterna dell'elettrodo allineando tre fori oblunghi nelle guarnizioni a scambio ionico. Riempire gli elettrodi con i rispettivi elettroliti (~25-30 mL) per evitare che le loro membrane si secchino.
   4. Non aggiungere un eccesso di elettrolita (più di 1/3 del volume della camera dell'elettrodo) che potrebbe accumulare pressione all'interno dell'elettrodo e causare perdite.
   5. Coprire le porte di raccolta del campione con il nastro sigillante fornito con le parti dell'assemblaggio dello strumento (Tabella dei materiali). Il lato delle porte di raccolta del campione può essere identificato dai due perni di allineamento verticali in metallo. In alternativa, utilizzare del nastro sigillante standard per sigillare le porte.
   6. Assemblare tutte le parti del gruppo della camera di messa a fuoco in sequenza (elettrodo anodico, nucleo della membrana in nylon, camera di messa a fuoco ed elettrodo catodico) sul dito di raffreddamento in ceramica.
   7. Riempire la camera di messa a fuoco con acqua distillata preraffreddata (volume totale di 60 mL per la cella IEF standard) utilizzando una siringa da 50 mL.
   8. Collegare lo strumento IEF in fase liquida a una corrente di acqua di raffreddamento a 4 ºC e far funzionare l'unità a 15 W e 3.000 V per 3-5 minuti o fino a quando la tensione si stabilizza.
      NOTA: Generalmente, entro un minuto, la tensione raggiungerà i valori massimi impostati. La pre-esecuzione con acqua distillata aiuta a rimuovere gli ioni residui dalla camera di messa a fuoco e dal nucleo della membrana in nylon.
   9. Spegnere la fonte di alimentazione e rimuovere l'acqua dalla cella utilizzando il raccoglitore di frazioni. Richiudere le porte di raccolta con nastro sigillante. La camera è ora pronta per caricare il campione.
5. Utilizzare una siringa da 50 ml con un ago smussato da 1-1/2 pollice da 19 G (fornito con lo strumento) e caricare il campione preparato con anfolita (60 ml in totale) nella cella attraverso le porte di raccolta del campione.
6. Rimuovere le bolle d'aria dalla cella del campione rimuovendo la cella di messa a fuoco dal supporto e picchiettando la camera dell'elettrodo per rimuovere le bolle. La presenza di bolle d'aria causerà fluttuazioni di tensione e corrente e influenzerà la corsa.
7. Collegare l'unità al liquido di raffreddamento ad acqua (4 °C) e avviare il frazionamento con l'alimentazione a 15 W costanti.
8. Far funzionare l'apparecchio per 3 ore o fino a quando la tensione raggiunge un valore costante.
   NOTA: Quando il campione inizia a mettere a fuoco, la tensione inizierà a salire gradualmente fino a raggiungere un valore costante.
9. Dopo la corsa, prepararsi a raccogliere le frazioni nella cassetta di raccolta (contenente 20 provette di plastica, 12 mm x 75 mm, volume 5-6 mL) collegata alla pompa del vuoto premendo il pulsante di raccolta ON nell'unità IEF.
10. Allineare i 20 pin di raccolta con le 20 porte di raccolta della cella di messa a fuoco sigillata con il nastro.
11. Spingere i perni di raccolta attraverso il nastro sigillante e accendere contemporaneamente la pompa del vuoto (Figura 1B, 1C e 1D).
    NOTA: Per ogni volta, nelle provette verranno raccolti circa 3 mL di frazioni da ciascuna camera. Le frazioni possono essere utilizzate per successive applicazioni a valle (SDS-PAGE per la quantificazione dei peptidi, TLC e bioassay per piccole molecole).

Risultati

Figura 1: Impostazione dell'apparato IEF in fase liquida e frazionamento dell'estratto vegetale di G. sylvestre. (A) Durante la corsa, (B) durante la raccolta delle frazioni, (C) dopo la raccolta delle frazioni e (D) parti dell'apparato IEF in fase liquida, 1) membrane a scambio ionico, 2) camera di focalizzazione e nucleo della membrana, 3) assemblaggio dell'elettrodo (negativo), 4) assemblag...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro per siringa da 0,45 μm	Fisher scientfic	09-720-004
Bio-Lyte 3/10 Anfolia	Bio-Rad	Codice 163-1113
Bio-Lyte 5/8 Anfolita	Bio-Rad	Codice: 163-1192
Termostato compatto per bassa temperatura	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Impostando il raffreddamento ad acqua a 4°C può funzionare anche a 0°C poiché quando passa attraverso il nucleo di raffreddamento Rotofor, la temperatura dell'acqua circolante sarà di circa 5 o più a seconda della tensione.
Estratto di foglie vegetali di Gymnema in polvere (>25% di acidi gimnemici)	Suan Farma, NJ Stati Uniti
Mini elettroforesi proteiforme	Bio-Rad
Misuratore di pH	Mettler Toledo	S20	Utile per determinare il pH delle frazioni Rotofor (IEF in fase liquida)
Rotofor	Bio-Rad	Codice 170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Manuale di istruzioni per il montaggio dell'unità)
RPMI-1640 Medio	HyClone	DH30255.01
Nastro sigillante	Bio-Rad	Codice 170-2960	Può essere utilizzato anche lo scotch
Centrifuga Sorvall legend micro 17	Termo scientifico	75002432