Elettroforesi capillare con affinità di spostamento di mobilità: un metodo per analizzare le interazioni campione-ligando in base alla migrazione differenziale dei complessi proteina-ligando

Abstract

Fonte: Nachbar M. et al., Analisi del disordine intrinseco di AtHIRD11 e del legame verso gli ioni metallici mediante elettroforesi su gel capillare ed elettroforesi capillare per affinità. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive il metodo per analizzare l'interazione proteina-ligando mediante elettroforesi capillare di affinità di spostamento della mobilità. Questo metodo può essere utilizzato per caratterizzare il comportamento di legame di una proteina con vari ligandi carichi.

Protocol

1. Prepara le soluzioni per l'analisi ACE

1. Preparare la soluzione 1 M di NaOH.
   1. Pesare 4,0 g di NaOH in un matraccio tarato da 100 mL.
   2. Riempilo fino al segno con acqua deionizzata per ottenere un brodo da 1 M.
2. Preparare l'acido etilendiamminotetraacetico 0,1 M (EDTA) in una soluzione di NaOH 0,1 M.
   1. Trasferire 10 mL di NaOH 0,1 M in un matraccio tarato da 100 mL utilizzando una pipetta a bulbo da 10 mL. Riempilo fino al segno con acqua deionizzata.
   2. Pesare 2,42 g di EDTA su una navicella per pesare e sciogliere il composto solido nei 100 mL di NaOH 0,1 M.
3. Preparare la soluzione tampone Tris (30 mM).
   1. Aggiungere 3,63 g di Tris, 200 ml di acqua deionizzata e una barra di agitazione in un becher da 500 ml. Posizionare il bicchiere su una piastra per mescolare e accenderlo.
   2. Inserire un elettrodo del pHmetro nel becher e regolare il pH a 7,4 utilizzando 0,1 M di HCl.
   3. Riempire la soluzione in un matraccio tarato da 1 L e riempire fino alla tacca con acqua deionizzata.
      NOTA: Questa procedura deve essere ripetuta o è necessario un matraccio tarato più grande poiché è necessario più di 1 L per l'intera analisi.
4. Preparare la soluzione di marcatore del flusso elettroosmotico (EOF) di acetanilide (60 μM).
   1. Aggiungere 6 mg di acetanilide e 100 mL di tampone Tris in un matraccio tarato da 100 mL.
   2. Immergere il matraccio tarato in un bagno ad ultrasuoni e accenderlo per 30 min.
5. Preparare il campione di soluzione (1 mg/mL).
   1. Mettere una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml su una bilancia di precisione e aggiungere 0,3 mg di polvere di AtHIRD11 liofilizzata nella provetta.
   2. Utilizzare una micropipetta per aggiungere 0,3 mL di un tampone Tris da 30 mM (pH 7,4) nella provetta. Agitare accuratamente il tubo per sciogliere la proteina.
6. Preparare le soluzioni del ligando.
   1. Preparare la soluzione madre di CaCl₂ (5 mM).
      1. Prendete una barca per pesare, mettetela su una bilancia analitica e pesate 36,76 mg di CaCl₂*H₂O.
      2. Utilizzando una micropipetta, lavare il CaCl₂*H₂O dal recipiente di pesata in un matraccio tarato da 50 mL con il tampone Tris precedentemente preparato.
      3. Riempire il matraccio tarato con il tampone Tris fino alla boa.
   2. Preparare le restanti soluzioni madre (5 mM).
      1. Ripetere il passaggio 1.6.1 utilizzando gli altri sali metallici invece di CaCl₂*H₂O [MgCl₂: 23,80 mg, BaCl₂: 26,02 mg, Sr(NO₃)₂: 52,91 mg, MnCl₂: 31,46 mg, SeCl₄: 52,91 mg, CoCl₂*2H₂O: 41,47 mg, CuCl₂*2H₂O: 42,62 mg, ZnCl₂: 3,41 mg e NiCl₂*6H₂O: 59,43 mg].
         nota: La soluzione di ZnCl₂ ha una concentrazione di 0,5 mM. Poiché sono state osservate forti interazioni tra gli ioni e la parete interna del capillare, la concentrazione è stata ridotta di un fattore di 10⁴.
   3. Preparare la soluzione di CaCl₂ da 500 μM.
      1. Riempire 10 mL della soluzione madre di CaCl₂ e metterla in un matraccio tarato da 100 mL.
      2. Riempire il matraccio tarato con un tampone Tris fino alla tacca e agitare il pallone.
   4. Preparare la soluzione di CaCl₂ da 250 μM.
      1. Riempire 5 mL della soluzione madre di CaCl₂ e metterla in un matraccio tarato da 100 mL.
      2. Riempire il matraccio tarato con un tampone Tris fino alla tacca e agitare il pallone.
   5. Ripetere i passaggi precedenti per le altre soluzioni predefinite.
7. Riempire le soluzioni nelle fiale.
   nota: Ogni corsa ripetuta richiede una serie di fiale di ingresso e uscita. L'uso di soluzioni di leganti freschi all'ingresso e all'uscita riduce i cambiamenti nel tempo di migrazione dopo ogni corsa.
   1. Riempire la soluzione di CaCl₂ da 250 μM in una siringa da 10 mL.
   2. Mettere un filtro PVDF da 0,22 μm sulla siringa e spingere 2 mL di soluzione attraverso il filtro utilizzando la siringa per eliminare questa soluzione filtrata.
   3. Riempire 10 flaconcini fino al volume massimo consentito con i restanti 250 μM di soluzione di CaCl₂ della siringa. Contrassegnare ciascuna come flaconcino di ingresso della soluzione CaCl₂ da 250 μM.
   4. Riempire 10 fiale fino a metà con la soluzione di CaCl₂ da 250 μM. Contrassegnare ciascuno come flaconcino di uscita della soluzione CaCl₂ da 250 μM.
   5. Ripetere i passaggi 1.7.1 - 1.7.4 per le altre soluzioni contenenti sali metallici.
   6. Ripetere i passaggi per ogni coppia di fiale di ingresso e di uscita utilizzando invece la soluzione di tampone Tris 30 mM (pH 7,4).
      nota: Il tampone Tris da 30 mmol/L pH 7,4 viene utilizzato tra una corsa e l'altra per ottenere dati sul tempo di migrazione della proteina in assenza di ioni metallici. È necessario trascurare i cambiamenti nell'EOF.
   7. Ripetere i passaggi precedenti per un flaconcino utilizzando invece la soluzione di marcatore EOF di acetanilide (60 μM). Inoltre, ripetere questi passaggi utilizzando invece la soluzione campione (1 mg/mL).

2. Analisi elettroforetica capillare di affinità

1. Condizionare il capillare
   1. Impostare il termostato a 23 °C.
      nota: La temperatura viene utilizzata secondo i protocolli pubblicati e può essere modificata in altre temperature. Tuttavia, le interazioni dipendono dalla temperatura e cambieranno di conseguenza.
   2. Lavare un capillare per 40 minuti a 2,5 bar con NaOH 0,1 M.
   3. Sciacquare il capillare per 10 minuti a 1,0 bar con acqua deionizzata.
   4. Lavare il capillare per 30 minuti a 1,0 bar con un tampone Tris da 30 mM (pH 7,4).
2. Preparazione per i metodi ACE
   1. Preparare il metodo per le misurazioni senza leganti.
      nota: L'acetanilide non è stato aggiunto alla soluzione del campione, poiché nasconde 2 picchi proteici.
      1. Sciacquare il capillare per 1 minuto a 2,5 bar con una soluzione di EDTA 0,1 M.
      2. Sciacquare il capillare per 1 minuto a 2,5 bar con acqua deionizzata.
      3. Sciacquare il capillare per 1,5 minuti a 2,5 bar con un tampone Tris per l'equilibratura.
      4. Iniettare la soluzione di acetanilide per 6 s a 0,05 bar e sostituire i flaconcini di ingresso e di uscita con i flaconcini di tampone Tris.
      5. Applicare 0,05 bar per 2,4 s in modo da spingere la soluzione di acetanilide dalla punta del capillare più all'interno.
      6. Applicare 10,0 kV per 6 minuti e rilevare il picco di acetanilide a una lunghezza d'onda di 200 nm.
      7. Ripetere i passaggi 2.2.1.1. - 2.2.1.6. utilizzando il campione proteico al posto della soluzione di acetanilide e rilevare tutti i picchi proteici.
   2. Preparare il metodo per le misurazioni con i ligandi.
      1. Sciacquare il capillare per 1 minuto a 2,5 bar con una soluzione di EDTA 0,1 M.
      2. Sciacquare il capillare per 1 minuto a 2,5 bar con acqua deionizzata.
      3. Sciacquare il capillare per 1,5 minuti a 2,5 bar con la soluzione di legante per l'equilibratura.
      4. Iniettare la soluzione di acetanilide per 6 s a 0,05 bar e sostituire i flaconcini di ingresso e di uscita con i flaconcini tampone contenenti ligando.
      5. Applicare 0,05 bar per 2,4 s in modo da spingere la soluzione di acetanilide dalla punta del capillare più all'interno.
      6. Applicare 10,0 kV per 6 minuti e rilevare il picco di acetanilide a una lunghezza d'onda di 200 nm.
      7. Ripetere i passaggi 2.2.2.1 - 2.2.2.6 utilizzando il campione proteico al posto della soluzione di acetanilide e rilevare tutti i picchi proteici.
   3. Ripetere alternativamente i passaggi 2.2.1 e 2.2.2 per calcolare la variazione dei rapporti carica-dimensione per le varie interazioni proteina-ione metallo.
      1. Cambiare la soluzione proteica ogni 60 ore con una nuova.
         nota: A questo punto, l'esperimento può essere messo in pausa. Questa procedura viene ripetuta almeno 10 volte per ogni concentrazione dei liganti poiché il modello di picco varia leggermente da corsa a corsa. Se la soluzione viene utilizzata per più di 60 ore, le variazioni diventano troppo grandi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Esempio AtHIRD11	Università di Shizuoka (Gruppo Prof. M. Hara)		Proteina deidrina di Arabidopsis thaliana espressa in Escherichia coli
Capillare di silice Barefaid,	Polymicro Technologies (Phoenix, Stati Uniti)	Codice 106815-0017	TSP050375 diametro interno 50 μm, diametro esterno 363 μm, rivestimento in poliimmide
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Germania)		Strumento per elettroforesi capillare; Al suo posto può essere utilizzato Agilent 7100 CE
Pipetta a bulbo 25 mL	Duran Group GmbH (Magonza, Germania)	24 338 14	Preparazione della soluzione del legante
Pallone tarato Duran glas 25 mL	Duran Group GmbH (Magonza, Germania)	24 671 1457	Preparazione della soluzione stock del legante
Pallone tarato Duran glas 10 mL	Duran Group GmbH (Magonza, Germania)	24 671 1054	Preparazione della soluzione stock del legante
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)	Codice 397229-5G	Marcatore di flusso elettroosmotico
Cloruro di manganese (II)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)	Codice: 13217	ligando
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)	431788-100G	Ingrediente per il risciacquo
Cloruro di bario	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)	Codice 202738-5G	ligando
Cloruro di nichel (II) esaidrato	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)	Codice 654507-5G	ligando
Cloruro di selenio (IV)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)	Codice 323527-10G	ligando
2-ammino-2-idrossimetilpropano-1,3-diolo (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)	Codice 252859-100G	Ingrediente tampone
Cloruro di zinco (II)	Merck Millipore ( Darmstadt, Germania)	1088160250	ligando
Nitrato di stronzio	Merck Millipore ( Darmstadt, Germania)	1078720250	ligando
Cloruro di calcio diidrato	Merck Millipore ( Darmstadt, Germania)	1371015000	ligando
Cloruro di rame(II) diidrato	Riedel-de Haën (Seelze, Germania)	Telefono 31286	ligando
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Germania)	G2070-91126	Pacchetti software per il funzionamento degli strumenti CE, l'acquisizione dei dati e la loro valutazione