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1. Preparazione dei campioni
- Raccogliere i tessuti dell'adenoma ipofisario (0,2 - 0,5 mg) dal reparto di neurochirurgia. Congelare immediatamente in azoto liquido, quindi trasferire a -80 °C per la conservazione.
- Aggiungere 2 mL di NaCl allo 0,9% in acqua distillata deionizzata (ddH2O). Utilizzare questa soluzione per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto (3x).
NOTE: ddH2O con una conducibilità di 18,2 MΩ/cm viene utilizzato in tutto il protocollo. Una parte del tessuto potrebbe andare persa durante il lavaggio del sangue dalla superficie di un tessuto.
- Aggiungere un volume (10 mL; 4 °C) della soluzione contenente acido acetico 2 M e 0,1% (v/v) di β-mercaptoetanolo per ogni 0,5 - 0,6 g di tessuto, omogeneizzare (1 min, 13.000 giri/min, 4 °C, 10x) con un omogeneizzatore tissutale, sonicare l'omogenato per 20 s, liofilizzare e conservare a -80 °C.
- Misurare il contenuto proteico dei campioni liofilizzati e omogeneizzati utilizzando il kit di analisi dell'acido bicinchoninico (BCA).
nota: La quantificazione BCA non è una quantificazione assoluta e il risultato misurato verrà modificato con un tecnico diverso e l'agente sperimentale. Per diversi esperimenti dovrebbe essere utilizzato uno standard di campionamento a concentrazione fissa. Pertanto, la quantità finale di proteine per ogni gel 2D sarà determinata con l'immagine a buona risoluzione colorata con argento o colorata con Coomassie negli esperimenti pre-progettati.
- Aggiungere circa 300 μg del campione omogeneizzato liofilizzato a un volume (282 μl) di tampone per l'estrazione delle proteine (8 M urea e 4% CHAPS), quindi riposare per 2 ore, sonicare a bagnomaria per 5 minuti, ruotare per 1 ora, sonicare nuovamente a bagnomaria per 5 minuti, ruotare di nuovo per 1 ora, e centrifugazione a 15.000 x g per 20 min.
- Preparare le soluzioni standard BSA con le concentrazioni indicate: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 μg/mL con lo standard BSA commerciale (2 mg/mL).
- Miscelare i reagenti BCA A e B (A:B = 50:1) come soluzione di lavoro BCA prima dell'uso.
- Aggiungere 0,1 mL del campione o della soluzione standard a 2 mL di soluzione di lavoro BCA in una provetta per microfuge, quindi miscelare e incubare a 37 °C per 30 min. Infine raffreddare a temperatura ambiente per 10 minuti e misurare un valore di562 nm di diametro esterno.
- Calcolare la linea lineare standard (A562 nm rispetto alla concentrazione di BSA) per ottenere un'equazione di regressione per calcolare il contenuto proteico del campione con un valore Adi 562 nm.
- Utilizzare 150 μg di campione liofilizzato equivalente alle proteine per la colorazione con argento, o 500 μg di proteine per la colorazione di Coomassie, per una striscia di gradiente di pH immobilizzata (IPG) di 18 cm pH 3-10 non lineare (NL).
nota: La striscia secca IPG ha uno spessore di 0,5 mm e una larghezza di 3 mm, con diverse lunghezze tra cui 7, 11, 13, 18 e 24 cm e diversi intervalli di pH tra cui pH 4-5, 4-7, 6-9 e 3-10 in un gradiente di pH lineare o non lineare. Il tampone IPG utilizzato deve adattarsi alla striscia.
- Aggiungere 250 μl di tampone di estrazione (7 M di urea, 2 M di tiourea, 4% (p/v) CHAPS, 100 mM DTT (aggiungere prima dell'uso), 0,5% v/v pharmalyte (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu di bromofenolo).
- Mantenere la soluzione al di sotto dei 30 °C, seguita da vortice per 5 minuti, sonicazione per 5 minuti e rotazione per 50 minuti.
- Aggiungere 110 μl di tampone di reidratazione (7 M di urea, 2 M di tiourea, 4% (p/v) di CHAPS, 60 mM di DTT (aggiungere prima dell'uso), 0,5% v/v di tampone IPG (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu di bromofenolo). Sonicare per 5 min. Quindi ruotare il campione per 50 minuti, vorticare per 5 minuti e centrifugare per 20 minuti a 15.000 x g.
- Raccogliere il surnatante (350 μL) come soluzione del campione di proteine.
2. Elettroforesi su gel bidimensionale
- IEF (First dimension): Eseguire l'IEF sul sistema di messa a fuoco isoelettrico come descritto di seguito.
- Aggiungere 350 μl della soluzione del campione proteico nella fessura di un supporto per striscia IPG da 18 cm.
- Applicare una striscia IPG di 18 cm con il lato rivolto verso il basso sulla soluzione del campione di proteine (evitare le bolle).
- Aggiungere 3-4 ml di olio minerale per coprire la striscia IPG.
- Assemblare il supporto della striscia IPG nel sistema di messa a fuoco isoelettrica con l'estremità appuntita sulla piastra posteriore (+) e l'estremità quadrata sulla piastra anteriore (-).
- Reidratare durante la notte (~18 ore a temperatura ambiente).
- Impostare i parametri IEF: corrente massima 30 μA per striscia, 20 °C; 250 V, 1 h, 125 Vh, passo e mantenimento; 1.000 V, 1 h, 500 Vh, gradiente; 8.000 V, 1 h, 4.000 Vh, gradiente; 8.000 V, 4 ore, 32.000 Vh, passo e mantenimento; e 500 V, 0,5 ore, 250 Vh, passo e mantenimento. Lascialo funzionare fino a un tempo totale di 7,5 h e 36,875 Vh.
- Dopo l'IEF, estrarre ogni striscia IPG e rimuovere l'olio minerale in eccesso con un tovagliolo di carta insolubile. Avvolgere ora la striscia in un foglio di pellicola trasparente e conservare a −80 °C.
nota: Il supporto della striscia IPG deve essere pulito con la soluzione detergente del supporto della striscia IPG e acqua distillata.
- SDS-PAGE (Seconda dimensione): Esecuzione di SDS-PAGE in un sistema di elettroforesi a celle verticali
nota: Ogni dimensione del gel SDS-PAGE deve essere di 255 x 190 x 1 mm.
- Utilizzare una rotella multi-gel per lanciare gel risolutivi al 12% di PAGE. Per la colata di gel 12% PAGE, eseguire i seguenti passaggi.
- Aggiungere 270 mL di ddH2O, 150 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL di soluzione madre di acrilammide/bisacrilammide al 40% (p/v) (29:1, 40% p/v di acrilammide e 1,38% p/v N, N'-metilenbisacrilammide), 3 mL di persolfato di ammonio al 10% e 150 μL di TEMED per preparare la soluzione di gel in un becher. Mescolate delicatamente ed evitate la formazione di bolle.
- Versare delicatamente la soluzione di gel nella camera di multicasting fino all'altezza del gel prevista (19 cm).
- Aggiungere immediatamente circa 3 ml di ddH2O su ciascun gel risolutivo per coprire i gel. Lasciare polimerizzare il gel per circa 1 ora.
- Preparare 20 L di tampone per elettroforesi (25 mM Tris, 192 mM glicerina e 0,1% SDS). Riempire il serbatoio tampone dell'unità di separazione per elettroforesi con questo tampone.
- Estrarre le strisce IPG focalizzate dal congelatore ed equilibrare le strisce per 10 minuti facendo oscillare delicatamente 4 mL di tampone di equilibrio riducente (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (p/v) SDS, 20% (v/v) glicerolo, 2% p/v DTT (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu bromofenolo).
- Equilibrare per 10 minuti facendo oscillare delicatamente le strisce IPG ridotte in 4 mL di tampone di equilibrio di alchilazione (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (p/v) SDS, 20% (v/v) glicerolo, 2,5% p/v iodoacetamide (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu bromofenolo).
- Durante l'equilibrio del gel, smontare la camera di multicasting ed estrarre la cassetta del gel risolutivo preparata. Risciacquare 3 volte con ddH2O. Rimuovere l'eccesso di ddH2O con un tovagliolo di carta insolubile e metterlo in un gel stander.
- Sciacquare le strisce IPG equilibrate con il tampone per elettroforesi e rimuovere il liquido in eccesso sulla superficie della striscia IPG con il tovagliolo di carta insolubile.
- Applicare una striscia IPG sul gel SDS-PAGE risolutivo e lasciare che il lato in plastica della striscia IPG entri in contatto con la lastra di vetro più lunga e l'estremità appuntita a sinistra.
- Versare rapidamente 3-4 mL di agarosio caldo all'1% nel tampone per elettroforesi SDS (~80 °C) per sigillare la striscia IPG sulla parte superiore di ciascun gel SDS-PAGE, e posizionare il lato superiore della striscia IPG verso la parte superiore della lastra di vetro più corta senza bolle, quindi polimerizzare per 10 minuti.
- Inserire la cassetta del gel assemblata verticalmente tra le guarnizioni di plastica nel sistema di elettroforesi verticale. Posizionare la parte superiore del gel con la striscia IPG accanto al catodo (-).
- Regolare il livello del tampone per elettroforesi per immergere la cassetta del gel.
- Collegare e impostare l'alimentatore/unità di controllo in modalità tensione costante e far funzionare a 200 V per circa 370 minuti monitorando il colorante.
- Dopo l'esecuzione, estrarre la cassetta del gel dal sistema di elettroforesi e rimuovere delicatamente il gel dalla cassetta del gel, evitando di strappare il gel, seguito dalla colorazione delle proteine separate da 2DE.