1. Caricare ed Eseguire il Gel
- Tutti i campioni devono essere preparati in modo adeguato per mantenere la funzione degli enzimi e utilizzati immediatamente dopo la raccolta o conservati congelati a -80°C. I campioni non devono contenere agenti riducenti (come il β-mercaptoetanolo) né devono essere bolliti prima del caricamento del gel.
- Aprire la busta contenente un gel all'interno di una cassetta, sciacquare la cassetta con acqua deionizzata.
- Rimuovere il nastro protettivo dalla parte inferiore della cassetta e il pettine dalla parte superiore del gel.
- Sciacquare i pozzetti tre volte con un tampone scorrevole (diluito a 1 volta in acqua deionizzata).
- Posizionare il gel nella Mini-Cell, assicurandosi che il lato più piccolo della cassetta sia rivolto verso l'interno. Bloccare in posizione con il cuneo di tensione in gel. La Mini-Cell consente di far funzionare uno o due gel in parallelo.
- Riempire la camera superiore (interna) con un tampone 1X sopra il livello dei pozzetti, verificare la presenza di eventuali perdite. In caso di perdite, rimuovere il tampone e riposizionare il gel.
- Riempire la camera inferiore con un tampone di scorrimento 1X.
- Caricare 10 μL di marcatore molecolare proteico in un pozzetto.
- Miscelare una quantità uguale di tampone di caricamento del gel e di campione e caricare nei pozzetti del gel utilizzando le punte di caricamento del gel (cambiate tra un campione e l'altro). Questi pozzetti possono essere caricati con un totale fino a 20 μl.
- Posizionare il coperchio sulla Mini-Cell e collegare i cavi degli elettrodi all'alimentatore. Inserire l'alimentazione e impostarla in modo che funzioni a 125 V costanti per 90 minuti. Verificare la formazione di piccole bolle sul filo della camera inferiore, che indicano la circolazione di corrente.
- Quando si esegue il primo gel, monitorare l'avanzamento della migrazione ogni 15 minuti, utilizzando il blu di bromofenolo incluso nel tampone di caricamento come indicatore. Lascia scorrere il gel fino a quando il colorante indicatore raggiunge il fondo del gel.
2. Rinominare e sviluppare il gel
- Per ogni gel, preparare 100 mL di tampone rinaturante 1X e 200 mL di tampone denaturante, entrambi in acqua deionizzata.
- Quando il colorante tracciante blu bromofenolo raggiunge il fondo del gel, spegnere l'alimentazione, aprire la Mini-Cell e rimuovere il gel. Separare i due lati della cassetta usando il coltello da gel (o una spatola per pesare). Taglia un angolo per segnare la direzione del gel.
- Rimuovere con cautela il gel dalla cassetta e metterlo in un contenitore con 100 ml di tampone rinaturalizzante. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
- Rimuovere il tampone di rinaturalizzazione e aggiungere 100 ml di tampone di sviluppo al gel. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
- Rimuovere il tampone di sviluppo e aggiungere altri 100 ml di tampone di sviluppo al gel. Incubare per una notte (16-18 ore) a 37°C.
- Rimuovere il tampone di sviluppo e risciacquare tre volte (5 minuti ciascuna) con acqua deionizzata agitando delicatamente a temperatura ambiente.
- Scansiona il gel per salvare l'esatto posizionamento delle bande standard proteiche poiché diventeranno meno o non visibili dopo la colorazione del gel.
- Colorare il gel aggiungendo 20 ml di SimplyBlue Safestain al gel. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
- Rimuovere SimplyBlue SafeStain e decolorare il gel in 100 ml o più di acqua deionizzata per un'ora a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
- Per ottenere risultati migliori, sostituire con acqua fresca deionizzata e incubare per un'altra ora o più a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
