Microscopia TIRF per visualizzare la dinamica dell'accoppiamento di actina e microtubuli

Abstract

Fonte: Henty-Ridilla, J.L., Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). (2022)

Questo video descrive TIRF, una tecnica basata sulla microscopia a riflessione interna totale per visualizzare le dinamiche di polimerizzazione dell'actina e dei microtubuli. Il metodo consente l'imaging ad alta risoluzione delle dinamiche di accoppiamento tra actina e microtubuli in tempo reale, che è essenziale per comprendere i crosstalk cellulari.

Protocollo

1. Lavare i vetrini coprioggetti

NOTA: Lavare i vetrini coprioggetti (24 mm x 60 mm, #1.5) secondo Smith et al., 2013.

1. Disporre i vetrini coprioggetti in un contenitore di plastica per la spedizione di vetrini.
2. Immergere i vetrini coprioggetti in sequenza nelle seguenti soluzioni e sonicare per 30-60 minuti, risciacquando con ddH₂O 10 volte tra una soluzione e l'altra: ddH₂O con una goccia di detersivo per piatti; 0,1 M KOH. Conservare i vetrini coprioggetti in etanolo al 100% per un massimo di 6 mesi.
   nota: Non toccare le superfici in vetro con le dita non guantate. Usa invece il forcipe.

2. Vetrini coprioggetti puliti con rivestimento (24 mm x 60 mm, #1.5) con mPEG- e biotina-PEG-silano

NOTA: Questo protocollo utilizza specificamente un sistema biotina-streptavidina per posizionare actina e microtubuli all'interno del piano di imaging TIRF. Possono essere utilizzati altri rivestimenti e sistemi (ad es. anticorpi, poli-L-lisina, miosina NEM, ecc.).

1. Aliquote di disgelo di polveri di PEG-silano e biotina-PEG-silano.
2. Sciogliere le polveri PEG in etanolo all'80% (pH 2,0) per generare soluzioni madre di rivestimento di 10 mg/mL di mPEG-silano e 2-4 mg/mL di biotina-PEG-silano, appena prima dell'uso.
   nota: Le polveri PEG appaiono spesso disciolte ma potrebbero non essere a livello microscopico. La corretta risospensione richiede ~1-2 minuti con pipettaggio costante. Gli utenti sono invitati a pipettare altre 10 volte dopo la comparsa della dissoluzione della polvere.
   cautela: Indossare guanti per proteggere la pelle dall'HCl concentrato quando si produce etanolo all'80% (pH 2,0).
3. Rimuovere il vetrino coprioggetti pulito (24 mm x 60 mm, #1,5) dalla conservazione dell'etanolo utilizzando una pinza. Asciugare con azoto gassoso e conservare in una capsula di Petri pulita.
4. Rivestire i vetrini coprioggetti con 100 μL di soluzione di rivestimento: una miscela di 2 mg/mL di mPEG-silano (MW 2.000) e 0,04 mg/mL di biotina-PEG-silano (MW 3.400) in etanolo all'80% (pH 2,0).
   nota: Per il rivestimento rado (consigliato) utilizzare 2 mg/mL di mPEG-silano e 0,04 mg/mL di biotina-PEG-silano. Per un rivestimento denso utilizzare 2 mg/mL di mPEG-silano, 4 mg/mL di biotina-PEG-silano.
5. Incubare i vetrini coprioggetti a 70 °C per almeno 18 ore o fino all'uso.
   nota: I vetrini coprioggetti rivestiti si degradano se conservati a 70 °C per più di 2 settimane.

3. Assemblaggio delle camere di flusso per immagini

1. Tagliare 12 strisce di nastro biadesivo a doppia faccia a una lunghezza di 24 mm. Rimuovere un lato del supporto del nastro e fissare i pezzi di nastro adiacenti alle sei scanalature presenti su una camera di imaging pulita.
   nota: Il nastro deve essere piatto per un corretto assemblaggio, altrimenti le camere di imaging perderanno. Rimuovere con cautela il supporto del nastro per evitare urti. Si consiglia di far scorrere le camere nastrate su una superficie pulita per levigare i contatti della camera a nastro.
2. Rimuovere il secondo pezzo di supporto del nastro per esporre il lato adesivo del nastro lungo ciascuna scanalatura della camera. Posizionare il nastro da camera con il lato rivolto verso l'alto su una superficie pulita.
3. Mescolare la resina epossidica e le soluzioni indurenti 1:1 (o secondo le istruzioni del produttore) in una piccola pesa
.
4. Utilizzare una punta P1000 per posizionare una goccia di resina epossidica mista tra le strisce di nastro all'estremità di ciascuna scanalatura della camera di imaging (freccia rossa; Figura 1A). Posizionare il nastro da camera/la resina epossidica con il lato rivolto verso l'alto su una superficie pulita.
5. Rimuovere un vetrino coprioggetti rivestito dall'incubatrice a 70 °C. Sciacquare sei volte le superfici rivestite e non rivestite dei vetrini coprioggetti con ddH₂O, asciugare con azoto gassoso filtrato e quindi fissarle alla camera di imaging con il lato del rivestimento del vetrino coprioggetti rivolto verso il nastro.
6. Utilizzare un puntale per pipette P200 o P1000 per applicare pressione sull'interfaccia nastro-vetro per garantire una buona tenuta tra il nastro e il vetrino coprioggetti.
   nota: Con una tenuta adeguata, il nastro biadesivo diventa traslucido. Le camere di imaging prive di contatti sufficienti per la camera a nastro perderanno.
7. Incubare le camere assemblate a temperatura ambiente per almeno 5-10 minuti per consentire alla resina epossidica di sigillare completamente i pozzetti della camera prima dell'uso. Le camere di perfusione scadono entro 12-18 ore dal montaggio.
   nota: A seconda del posizionamento del nastro e dello spessore del nastro biadesivo utilizzato, la camera assemblata avrà un volume finale di 20-50 μL.

4. Condizionamento delle camere di perfusione

1. Utilizzare una pompa di perfusione (velocità impostata su 500 μL/min) per scambiare in sequenza le soluzioni di condizionamento nella camera di perfusione come segue:
   1. Flusso di 50 μl di BSA all'1% per adescare la camera di imaging. Rimuovere il tampone in eccesso dal serbatoio del raccordo Luer-lock.
   2. Flusso 50 μL di streptavidina 0,005 mg/mL. Incubare per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone in eccesso dal serbatoio.
   3. Flusso di 50 μl di BSA all'1% per bloccare il legame aspecifico. Incubare per 10-30 s. Rimuovere il tampone in eccesso dal serbatoio.
   4. Flusso 50 μL di tampone TIRF caldo (37 °C) 1x (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glucosio, 0,25% (v/v) metilcellulosa (4.000 cp)).
      nota: Non rimuovere il tampone in eccesso dal serbatoio. In questo modo si evita che la camera si secchi, introducendo bolle d'aria nel sistema.
   5. Opzionale: Flusso di 50 μL di semi di microtubuli stabilizzati e biotinilati al 50% diluiti in 1x tampone TIRF.
      nota: La diluizione corretta deve essere determinata empiricamente e contenere la variabilità da lotto a lotto. Una diluizione che produce 10-30 semi per campo visivo funziona bene con questa configurazione.

5. Preparazione del microscopio

NOTA: Le reazioni biochimiche contenenti filamenti dinamici di actina e microtubuli vengono visualizzate/eseguite utilizzando un microscopio TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) invertito dotato di laser a stato solido da 120-150 mW, un obiettivo TIRF a immersione in olio 63x corretto in temperatura e una fotocamera EMCCD. Le proteine in questo esempio sono visualizzate alle seguenti lunghezze d'onda: 488 nm (microtubuli) e 647 nm (actina).

1. Impostare il riscaldatore del tavolino/obiettivo in modo che mantenga una temperatura di 35-37 °C almeno 30 minuti prima dell'imaging della prima reazione biochimica.
2. Impostare i parametri di acquisizione dell'immagine come segue:
   1. Impostare l'intervallo di acquisizione su ogni 5 s per 15-20 min.
   2. Imposta le esposizioni laser 488 e 647 su 50-100 ms al 5%-10% di potenza. Impostare l'angolo TIRF appropriato per il microscopio.
      nota: Indipendentemente dalla configurazione del microscopio, il modo più semplice per impostare la potenza del laser, l'esposizione e l'angolo TIRF è quello di effettuare regolazioni sulle immagini di entrambi i polimeri da soli (vedere 5.2.2.1 e 5.2.2.2, di seguito). Si consiglia vivamente agli utenti di utilizzare le impostazioni di potenza ed esposizione del laser più basse che consentano comunque il rilevamento.
      1. Regolare la reazione di polimerizzazione (Figura 1C) per avviare l'assemblaggio del filamento di actina e acquisire immagini a 647 nm. Apportare le opportune modifiche.
      2. Regolare la reazione di polimerizzazione in un secondo pozzetto di perfusione condizionato per avviare l'assemblaggio dei microtubuli (Figura 1C) e visualizzare a 488 nm. Apportare le opportune modifiche.

6. Preparazione di miscele di reazioni proteiche

1. Preparare una soluzione madre di tubulina marcata in fluorescenza.
   1. Determinare la concentrazione di tubulina non marcata fatta in casa tramite spettrofotometria ad Abs₂₈₀, come segue:
      1. Spettrofotometro a vuoto con 1xBRB80 privo di GTP.
      2. Calcolare la concentrazione di tubulina utilizzando il coefficiente di estinzione determinato di 115.000 ^{M-1 cm-1} e la seguente formula:
         
   2. Risospendere la 488-tubulina marcata con lisina liofilizzata prodotta in commercio a 10 μM (1 mg/mL; etichetta al 100%) con 20 μL di 1x BRB80 privo di GTP.
   3. Scongelare un'aliquota di 7,2 μL di 100 μM di tubulina riciclata non marcata su ghiaccio.
      nota: La tubulina riciclata è fondamentale per il successo dell'assemblaggio dei microtubuli in vitro perché rimuove i dimeri incompetenti per la polimerizzazione che si formano nelle scorte proteiche congelate.
   4. Combinare 3 μL di 10 μM di 488-tubulina con l'aliquota da 7,2 μL di 100 μM di tubulina non marcata, non più di 15 minuti prima dell'uso.
2. Preparare la soluzione madre di actina marcata in fluorescenza.
   1. Per le proteine fatte in casa, determinare la concentrazione e l'etichetta percentuale di actina tramite spettrofotometria AbsAbs₂₉₀ e_{Abs 650}, come segue:
      1. Spettrofotometro a vuoto con tampone G.
      2. Calcolare la concentrazione di actina non marcata utilizzando il coefficiente di estinzione determinato di 25.974 ^{M-1 cm-1} e la seguente formula:
         
      3. Calcola la concentrazione di lisina marcata con Alexa-647-actina utilizzando il coefficiente di estinzione dell'actina non marcata, il fattore di correzione del fluo di 0,03 e la seguente formula:
         
      4. Calcola l'etichetta percentuale di Alexa-647-actina utilizzando il ε determinato per Alexa-647 di 239.000 ^{M-1 cm-1}, come segue:
         
   2. Scongelare un'aliquota da 2 μL di 3 μM di actina di biotina marcata al 100% (marcata sui residui di lisina). Diluire 10 volte aggiungendo 18 μl di tampone G.
   3. Combinare 3 μL di actina biotinilata diluita e volumi appropriati di actina non marcata ed etichettata (sopra) in modo tale che la miscela finale sia di 12,5 μM di actina totale con il 10%-30% di actina fluorescente.
      nota: Più del 30% di monomeri fluorescenti di actina (finale) possono compromettere la risoluzione dell'imaging poiché i filamenti diventano difficili da distinguere dallo sfondo.
3. Preparare le miscele di reazione (Figura 1C).
   1. Preparare la miscela di citoscheletro (provetta A) combinando 2 μl della miscela madre di actina da 12,5 μM (6.2.3) con la miscela madre di tubulina (6.1.4), non più di 15 minuti prima dell'imaging. Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   2. Preparare la miscela di reazione proteica (Provetta B) combinando tutti gli altri componenti e proteine sperimentali, tra cui 2x tampone TIRF, anti-candeggina, nucleotidi, tamponi e proteine accessorie. Un esempio è mostrato nella Figura 1C.
      nota: La diluizione finale si traduce in un tampone TIRF 1x che contiene ATP, GTP e forza ionica entro l'intervallo fisiologico stimato.
4. Incubare separatamente la provetta A e la provetta B a 37 °C per 30-60 s. Per avviare la reazione, mescolare e aggiungere il contenuto della provetta B alla provetta A (sotto).

7. Immagine actina e dinamica dei microtubuli

1. Condizionare bene la perfusione (Figura 1B; passaggio 4, sopra).
2. Avviare l'assemblaggio simultaneo dell'actina e dei microtubuli aggiungendo il contenuto della provetta B (miscela di reazione) alla provetta A (miscela di citoscheletro) (Figura 1C).
3. Flusso di 50 μL della reazione contenente 1x tampone TIRF integrato con 15 μM di tubulina libera, 1 mM di GTP e 0,5 μM di actina monomeri e volumi appropriati di controlli tampone.
4. Registra filmati time-lapse utilizzando il software del microscopio per acquisirli ogni 5 s per 15-20 min.
   nota: L'inizio della dinamica dell'actina e dei microtubuli avviene entro 2-5 minuti (Figura 2). Ritardi più lunghi indicano problemi con il controllo della temperatura o problemi legati alla concentrazione delle proteine nella miscela di reazione.
5. Condizionare un nuovo pozzetto di perfusione (fase 4) e sostituire il volume del tampone con una o più proteine regolatorie di interesse (ad esempio, Tau) e controlli tampone (Figura 1C). Acquisire come descritto nel passaggio 7 (sopra) per valutare le proteine regolatorie per le funzioni emergenti dei microtubuli di actina.

Risultati

Figura 1. Schemi sperimentali: assemblaggio della camera di flusso all'acquisizione dell'immagine. (A) Assemblaggio della camera di imaging. Dall'alto verso il basso: le camere di imaging IBIDI sono fissate con nastro adesivo lungo i pozzetti di perfusione (indicati con una freccia); il secondo strato (bianco) di supporto in nastro (lasciato nell'immagine mostrata per orientare meglio gli utenti) viene rimosso e la ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1% BSA (w/v)	Fisher Scientifico	BP1600-100	A questo scopo (blocco delle camere TIRF), il BSA viene risospeso in ddH20 e filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm.
1× BRB80	casereccio		80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 con KOH
80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 con KOH	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	G2133-50KU	In combinazione con catalasi, aliquotare e conservare a -80 oC fino all'uso
100 μM di tubulina	Cytoskeleton Inc, Denver, CO	T240	Le tubuline fatte in casa devono essere riciclate prima dell'uso per rimuovere la tubulina incompetente alla polimerizzazione (Hyman et al. (1992)29; Li e Moore (2020)30 ). Le tubuline disponibili in commercio sono spesso troppo diluite per essere riciclate, ma funzionano bene se risospese secondo le istruzioni del produttore e pre-eliminate tramite ultracentrifugazione (278.000 × g) per 60 minuti, prima dell'uso.
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO	A-08	Risospeso in ddH20 (pH 7,5) e filtro sterilizzato.
100 mM GTP	Fisher Scientifico	AC226250010	Risospeso in 1× BRB80 (pH 6,8) e filtrato sterilizzato.
Laser a stato solido da 120-150 mW	Leica Microsystems	11889151; 11889148
2 mg/mL di catalasi	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	C40-100	In combinazione con glucosio ossidasi, aliquotare e conservare a -80 oC fino all'uso
2× Tampone TIRF	Homemad		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucosio, 0,5% (v/v) metilcellulosa (4.000 cp); Nota: 1 μL di 0,1 M GTP e 1 μL di 0,1 M di ATP aggiunti separatamente alle reazioni TIRF per evitare ripetuti cicli di congelamento-disgelo.
24 × 60 mm, vetro di copertura #1.5	Fisher Scientific, Waltham, MA	Codice 22-266882	Il vetro di copertura deve essere lavato accuratamente prima dell'uso (Smith et al. (2014)22 )
Blocco termico a 37 oC
Bagnomaria a 37 oC
5 mg/mL di streptavidina (600x stock)	Avantor, Filadelfia, PA	RLS000-01	Risospeso in Tris-HCl (pH 8,8); diluire l'aliquota a 1× in tampone HEK il giorno dell'uso
5 min Resina epossidica e indurente	Loctite, Collina Rocciosa, CT	1365736	La combinazione di resina e indurente può richiedere fino a 30 minuti per polimerizzare.
50% semi di microtubuli biotinilati-GpCpp	Citoscheletro Inc; Casereccio	T333P	(opzionale) I semi di microtubuli stabilizzati con GppCpp o Taxol possono mediare in modo più efficiente la polimerizzazione dei microtubuli. Il taxolo e il GppCpp stabilizzano i microtubuli in modi diversi che possono influenzare la struttura del reticolo dei microtubuli e la capacità di alcune proteine regolatrici di legarsi alla porzione stabilizzata del microtubulo. Un metodo per produrre diversi tipi di semi di microtubuli è delineato in Hyman et al. (1992).
Incubatrice 70 C
Stock di actina mix	Fatto in casa: questo protocollo		Una miscela di actina da 12,5 μM composta da actina marcata (fluorescente e biotinilata) e non marcata per un massimo di sei reazioni. Nella reazione finale TIRF vengono utilizzati 2 μL di stock. La concentrazione finale di actina utilizzata in ciascuna reazione è di 0,5 μM (10% Alexa-647; 0,09% marcato con biotina).
Controlli del buffer appropriati	casereccio		Combinazione di tamponi di tutte le proteine oggetto di valutazione
Biotina-PEG-silano (MW 3.400)	Laysan Bio Inc	biotina-PEG-SIL-3400	Dispensato in aliquote da 2-5 mg, riempito con azoto, parafilmato chiuso e conservato a -20 C con essiccante fino all'uso
Actina biotinilata	Citoscheletro Inc; Casereccio	AB07	La biotina-actina viene prodotta mediante marcatura sui residui di lisina e quindi si presume che sia marcata almeno al 100%, ma varia a seconda dei diversi lotti/preparati. Le concentrazioni ottimali di actina biotinilata devono essere determinate empiricamente per usi particolari/disegni sperimentali. Concentrazioni più elevate consentono un tracciamento più efficiente, ma possono ostacolare la polimerizzazione o le interazioni con le proteine regolatorie. Qui, una piccola percentuale (0,09% o 900 pM) di actina biotinilata è presente nella reazione finale TIRF.
Detersivo per piatti	Alba, Procter e Gamble, Cincinnati, OH		Per ragioni sconosciute, la versione blu pulisce i vetrini coprioggetti in modo più efficiente rispetto agli altri colori disponibili.
Ghiaccio secco
Actina marcata in fluorescenza	Citoscheletro Inc; Casereccio	AR05	L'actina marcata in modo fluorescente fatta in casa è conservata in un tampone G integrato con glicerolo al 50% a -20 C (Spudich et al. (1971) 47; Liu et al. (2022)48 ). L'actina marcata con fluorescenza viene dializzata contro il tampone G e preeliminata tramite ultracentrifugazione per 60 minuti a 278.000 × g prima dell'uso.
Tubulina marcata con fluorescenza	Citoscheletro Inc	TL488M, TLA590M, TL670M	Risospeso in 20 μl di 1× BRB80 (concentrazione finale di 10 μM) e pre-chiarito tramite ultracentrifugazione (278.000 × g) per 60 minuti, prima dell'uso.
Tampone G	casereccio		3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM DTT, 0,2 mM ATP
Buffer HEK	casereccio		20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl
ghiaccio
Secchiello per il ghiaccio
Camera di imaging	IBIDI, Fitchburg, WI	Codice 80666	Ordina le camere senza fondo per utilizzare diversi rivestimenti del vetrino coprioggetti
Telecamera EMCCD iXon Life 897	Andor, Belfast, Irlanda del Nord	8114137
Software per microscopio LASX Premium	Leica Microsystems	8114137
Metilcellulosa (4.000 cp)	Sigma Aldrich Inc	Codice: M0512
Base del microscopio dotata di modulo TIRF	Leica Microsystems, Wetzlar, Germania	11889146
mPEG-silano (MW 2.000)