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1. Condurre l'allineamento giornaliero LLSM
NOTA: (Importante) Questo protocollo di allineamento si basa sullo strumento LLSM utilizzato (vedi la Tabella dei Materiali). Ogni LLSM può essere diverso e richiedere diverse strategie di allineamento, in particolare quelle costruite in casa. Eseguire l'allineamento di routine appropriato e continuare con la sezione 2.
- Aggiungere 10 mL di acqua più 30 μL di fluoresceina (1 mg/mL di stock) al bagno LLSM (~10 mL di volume), premere Image (Home) per spostare l'obiettivo nella posizione dell'immagine e osservare un singolo fascio laser di Bessel. Allineare il raggio laser utilizzando le guide e la regione di interesse (ROI) preimpostata per rendere il raggio un modello sottile bilanciato in tutte le direzioni.
- Il raggio dovrebbe apparire focalizzato anche nella fotocamera del cercatore. Utilizzare due regolatori di inclinazione dello specchio, un micrometro superiore, la messa a fuoco e un collare dell'obiettivo di emissione per la regolazione. Vedere la Figura 1, A e B per la trave correttamente allineata.
- Lavare il bagno e gli obiettivi con almeno 200 ml di acqua per rimuovere completamente la fluoresceina.
- Sfere fluorescenti standard per immagini nei mezzi di imaging (preparate facendo aderire le perline a un vetrino coprioggetti da 5 mm con poli-L-lisina, vedere la Tabella dei materiali; questo può essere pre-preparato e riutilizzato) per la funzione di diffusione fisica del punto (PSF) nei mezzi di imaging.
NOTA: Ci può essere solo una perlina in vista per la successiva elaborazione, quindi cerca di trovare una perlina che sia da sola nel visualizzatore o che possa essere facilmente ritagliata per ottenere una singola perlina.
- Attiva il dithering impostandolo su 3 nella casella "Intervallo X Galvo". Premere Live per visualizzare il campo corrente. Spostati lungo la direzione Z per trovare il vetrino coprioggetti e le perline. Trova il centro di un cordone muovendoti lungo Z, premi Stop per mettere in pausa il laser. Controllare 3D, premere Centro e quindi premere Esegui. Questo raccoglierà i dati.
- Regolare manualmente lo specchio inclinabile, il collare dell'obiettivo e il micrometro di messa a fuoco per ottenere i valori di grigio più elevati, quindi regolare se necessario per ottenere modelli appropriati per le modalità di acquisizione scansione dell'obiettivo, z galvo, z+obiettivo (totPSF) e scansione del campione (samplePSF). Vedere la Figura 1 C-F per le proiezioni di intensità massima (MIP) correttamente regolate.
nota: Le varie modalità di acquisizione (scansione obiettivo, z galvo, z+obiettivo e scansione campione) cambiano il modo in cui il foglio luminoso si muove attraverso il campione. Tutte le modalità di scansione devono essere utilizzate per l'allineamento.
- La scansione del campione mostra come verranno raccolti i dati durante l'esperimento. Raccogliere il PSF campione premendo Esegui in modalità di scansione del campione per il raddrizzamento e la deconvoluzione. Cambia i laser in tre modalità di colore (488, 560, 647) e premi nuovamente Esegui.
nota: Poiché le immagini LLSM sono ad un angolo (57,2°), le immagini catturate in modalità "scansione campione" vengono raccolte con questo angolo e sono quindi "inclinate". L'inclinazione è il processo di correzione di questo angolo e di "riallineamento" dell'immagine a un vero z-stack. Questi dati devono essere raccolti nei mezzi di imaging e in tutti i canali che verranno ripresi durante l'esperimento. Se questo non viene raccolto correttamente, i dati non verranno correttamente distorti. Allo stesso modo, assicurarsi che il fluido sia stato riscaldato a 37 °C (o alla temperatura sperimentale desiderata).
2. Configurare le Celle con LLSM
- Aggiungere 100.000 cellule presentanti l'antigene (APC) (50 μL) a un vetrino coprioggetti circolare di 5 mm di diametro e lasciarle riposare per 10 minuti.
- Ingrassare il portacampioni, quindi aggiungere il vetrino coprioggetti con la cella rivolta verso l'alto. Aggiungere una goccia di materiale di imaging sul retro del vetrino coprioggetti per evitare bolle prima di metterlo nella vasca da bagno. Avvitare il sample holder sul piezo e premere Image (Home).
- Trovare un APC per l'immagine per assicurarsi che l'LLSM e il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) funzionino correttamente.
nota: Immaginiamo a passi di 0,4 μm con incrementi di 60 z e un'esposizione di 10 ms per due colori con un dithering impostato su 3, il che si traduce in 1,54 s per fotogramma dell'immagine 3D con risoluzione XY di ~200 nm e Z di 400 nm. Potrebbe essere necessario regolare queste impostazioni in base alle dimensioni della cella, alla risoluzione z desiderata e alla potenza del segnale della tecnica di etichettatura fluorescente utilizzata. L'utilizzo dell'energia laser varia anche in base alla tecnica di etichettatura fluorescente utilizzata.
- Premere Live per visualizzare l'immagine corrente. Spostati lungo Z per trovare il vetrino coprioggetti e le celle.
- Trova il centro di un APC muovendoti nella direzione Z, quindi premi Stop per mettere in pausa il laser. Controllare 3D e inserire le impostazioni desiderate, premere Centro e quindi premere Esegui. Questo raccoglierà i dati.
- Abbassare il tavolino in posizione di carico e aggiungere 50 μl di cellule T nei terreni di imaging (100.000 cellule) in senso gocciolato direttamente sopra il vetrino coprioggetti. È meglio lasciare che si formi una goccia all'estremità del puntale della pipetta e poi toccare il puntale con il liquido del bagno. Solleva il palco facendo clic su "Immagine (Ritorno)".
- Inizia l'imaging. Assicurati di impostare la dimensione della pila desiderata e la durata del time-lapse. Ad esempio, è possibile creare un'immagine di 60 z-stack con una dimensione del passo di 0,4 μm e inserire 500 fotogrammi di tempo. (In genere) interrompere la registrazione prima che vengano raggiunti i 500 fotogrammi per evitare il fotosbiancamento. Utilizzare la modalità Live per cercare coppie di celle e, quando sono state inserite le impostazioni pronte e desiderate, premere Esegui per raccogliere i dati. Vedere la Figura 2 per un esempio.
