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1. Preparazione del vetrino del microscopio
NOTA: Le cellule U87 MG della terza-decima generazione con alta attività vengono utilizzate negli esperimenti SPT.
- Sterilizzare vetrini coprioggetti da 22 mm × 22 mm già puliti con la soluzione Piranha immergendoli in etanolo (99,9%).
- Utilizzare una pinza per estrarre il vetrino coprioggetto dalla soluzione di etanolo (passaggio 1.1) e sterilizzare bruciando etanolo sul fuoco. Una volta bruciato tutto l'etanolo, mettere i vetrini coprioggetti in una capsula di plastica per colture cellulari (35 x 10 mm) riempita con 2 mL di terreno cellulare (senza rosso fenolo).
- Aggiungere 50 μl di sospensione cellulare sul vetrino coprioggetti e spingere delicatamente la capsula avanti e indietro e a sinistra e a destra per distribuire uniformemente le cellule. Posizionalo in un'atmosfera umidificata.
- Quando le cellule U87 MG sul vetrino coprioggetti raggiungono una confluenza del 20%-40% (~12 ore), aggiungere 20 μL di CTAB-AuNR (nanobarre d'oro sintetizzate con molecola di bromuro di ammonio cetiltrimetilammonio come agente protettivo, 138 pM) nel piatto e disperdere. Incubare in atmosfera umidificata per 5 min.
- Aggiungere 100 μl del terreno di coltura (senza rosso fenolo) dalla piastra nella fase 1.4 nella scanalatura del vetrino scanalato (Figura 1) che viene prepulito con la soluzione Piranha.
- Estrarre il vetrino coprioggetti dal piatto e capovolgerlo sulla parte superiore della scanalatura del vetrino del microscopio (Figura 1). Sigillalo con lo smalto, lascialo asciugare e posizionalo sul palco per eseguire esperimenti SPT.
2. Esecuzione di esperimenti di tracciamento di singole particelle con la microscopia in campo scuro (Figura 1).
- Mettere una goccia d'olio sul condensatore in campo scuro immerso nell'olio (apertura numerica (NA) 1,43-1,20) e ruotare la manopola per fare in modo che il condensatore tocchi il vetrino.
- Mettere una goccia d'olio sulla parte superiore del vetro di copertura e ruotare la manopola di messa a fuoco per fare in modo che l'obiettivo a immersione in olio 60x (NA 0,7–1,25) tocchi l'olio.
- Accendere la sorgente luminosa e ruotare leggermente la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco il piano di imaging.
nota: Nel campo visivo, lo sfondo è nero, le celle sono luminose e i CTAB-AuNR (rapporto d'aspetto ~ 2:1, Figura 2) sono piccoli punti di dispersione colorati (rossi, gialli o verdi).
- Cattura la luce di dispersione del campione con una fotocamera CMOS a colori. Fare clic sull'icona "Fotocamera" nel software per registrare ed esportare il formato TIFF per salvare le immagini.
3. Acquisizione dati
- Estrarre un'unica traiettoria a lungo termine
- Operare come descritto nella Figura 3 per convertire le immagini in campo scuro delle serie temporali dalla modalità "colore RGB" alla modalità "8 bit". Nell'immagine J fare clic su Immagine | Tipologia | 8 bit. Per regolare il contrasto, fare clic su Immagine | Regola | Luminosità | Contrasto.
- Seleziona una particella di destinazione e taglia gli sfondi delle serie temporali con la boxing e l'eliminazione dello sfondo con "Ctrl+X".
- Apri la finestra di rilevamento delle particelle e di collegamento delle particelle facendo clic sul pulsante "Plugin | Tracciatore di particelle classico | Tracciatore di particelle".
- Impostate Raggio su 6, Taglio su 0 e Percentile su 0,01%.
nota: Per rilevare la particella, regolare i tre parametri precedenti con l'assistenza di Anteprima. Assicurarsi che il raggio sia leggermente più grande della particella di destinazione e più piccolo della più piccola separazione tra le particelle. Il percentile è il limite inferiore della distribuzione dell'intensità che deve essere costituita da particelle candidate.
- Impostare l'intervallo di collegamento su 5 e lo spostamento su 10.
nota: Per collegare la particella tra fotogrammi adiacenti consecutivi, regolate i due parametri precedenti. Lo spostamento è il numero massimo di pixel che una particella può spostare tra due fotogrammi successivi, mentre l'intervallo di collegamento è il numero di fotogrammi consecutivi da considerare per determinare la migliore corrispondenza corrispondente.
- Fare clic su "OK" per aprire la finestra dei risultati di ParticleTracker e visualizzare i risultati.
- Fare clic su "Visualizza tutte le traiettorie" per ispezionare le traiettorie generate.
- Fare clic sul menu "Ricollega particelle" in alto per ricollegare le particelle rilevate con diversi intervalli di collegamento e parametri percentili, se la traiettoria generata dal software non corrisponde alla traiettoria in movimento dell'AuNR.
- Fare clic su "Salva rapporto completo" per salvare i risultati se la traiettoria generata dal software e la traiettoria mobile dell'AuNR corrispondono.
NOTA: Un esempio di estrazione di una singola traiettoria a lungo termine con l'immagine J è mostrato nella Figura 4.
