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1. Modifica del microscopio e dell'obiettivo
- Inserire uno specchio 50/50 nella ruota portafiltri del microscopio a fluorescenza utilizzando un cubo filtrante appropriato (Figura 1). Maneggiare lo specchio 50/50 con cura poiché spesso hanno un rivestimento antiriflesso.
nota: Abbiamo usato uno specchio 50/50 in un cubo filtrante vuoto del microscopio. Lo specchio 50/50 viene inserito dove si trova lo specchio dicroico.
- Utilizzare un obiettivo a olio ad alto ingrandimento/alta apertura numerica (NA).
nota: In questo protocollo, abbiamo utilizzato un obiettivo 100x/1.3 NA.
2. Preparazione della camera per far aderire i microtubuli alla superficie
- Pulire i vetrini da microscopio e i vetrini coprioggetti da 22 mm x 22 mm (per microscopio verticale) o i vetrini coprioggetti da 22 mm x 22 mm e 18 mm x 18 mm (per microscopi invertiti). Modificate la superficie in base alle esigenze. Ad esempio, pulire i vetrini coprioggetti utilizzando un detergente alcalino (vedere la Tabella dei materiali) seguito da etanolo al 100% con lavaggi con acqua distillata tra un lavaggio e l'altro.
- Tagliare strisce larghe 3 mm di pellicola di plastica di paraffina (vedi Tabella dei materiali) usando una lama di rasoio e un altro vetrino da microscopio come bordo.
- Posizionare due strisce di pellicola di paraffina di plastica a 3 mm di distanza l'una dall'altra su un vetrino coprioggetto pulito da 22 x 22 mm. Quindi posizionare un vetrino coprioggetti da 18 mm x 18 mm per formare un canale. Se si utilizza un microscopio verticale, posizionare le strisce sopra un vetrino da microscopio pulito e quindi posizionare un vetrino coprioggetti sopra.
- Posizionare il vetrino coprioggetti (o vetrino) su un blocco termico a 100 °C per 10-30 s affinché la pellicola di paraffina formi un canale sigillato.
- Flusso in 50 μg/mL di anticorpo [in Brinkley Buffer 1980 (BRB80)] per perfusione utilizzando una pipetta. Incubare per 10 min.
nota: Usiamo anticorpi anti-rodamina per legare i semi di microtubuli marcati con rodamina alla superficie. In alternativa, l'avidina può essere utilizzata per legare semi di microtubuli marcati con biotina o a particelle d'oro biotinilate. Per osservare semplicemente i microtubuli in assenza di tubulina in soluzione (cioè un test non dinamico), si può utilizzare un anticorpo anti-tubulina.
- Lavare cinque volte con tampone BRB80. Si consiglia di filtrare le soluzioni utilizzando un filtro da 0,22 μm.
- Versare in poloxamer 407 all'1% (un copolimero triblocco) in BRB80 per bloccare la superficie contro il legame aspecifico. Incubare per 10 min.
- Lavare cinque volte con tampone BRB80.
- Il campione è pronto per essere posizionato sul microscopio. Per evitare che il campione si secchi, aggiungere due goccioline di tampone BRB80 alle estremità del canale e rabboccare quando necessario.
3. Allineamento del microscopio
- Posizionare il campione sul tavolino del microscopio. Accendere la sorgente luminosa epi-illuminazione.
- Concentrati sulla superficie del campione. Osserverai più superfici mentre l'obiettivo viene spostato su e giù a causa della riflessione posteriore della luce dall'ottica all'interno del percorso ottico. Un buon metodo per trovare la superficie del campione è concentrarsi sul bordo del film di paraffina. Una volta trovata la superficie, impostare il campo visivo al centro della camera.
- Centrare il diaframma di campo nel campo visivo chiudendolo a metà e utilizzando le viti di regolazione. Una volta allineato, riaprire il diaframma.
nota: La regolazione della vite deve essere eseguita solo sporadicamente, forse ogni 3-6 mesi o durante la risoluzione dei problemi.
- Far scorrere la lente Bertrand per visualizzare la pupilla d'uscita (piano focale posteriore) dell'obiettivo.
- Chiudere il diaframma di apertura (AD) oltre i bordi della pupilla d'uscita dell'obiettivo.
- Utilizzare le viti di regolazione per centrare l'AD con la pupilla d'uscita. Ricontrolla aprendo l'AD e facendo combaciare i suoi bordi con quelli della pupilla d'uscita.
nota: Questa regolazione deve essere eseguita solo sporadicamente.
- Impostare il diaframma di apertura a circa 2/3 del NA dell'obiettivo.
4. Imaging di microtubuli stabilizzati o particella d'oro da 40 nm
NOTA: I microtubuli stabilizzati e le nanoparticelle d'oro servono come buoni campioni di controllo. Si consiglia di visualizzare i microtubuli attaccati alla superficie o le nanoparticelle d'oro come primo passo per valutare le prestazioni IRM e aiutare a impostare l'apertura ottimale del diaframma (sezione 7).
- Impostare il tempo di esposizione della fotocamera su 10 ms e regolare l'illuminazione in modo da saturare quasi completamente la gamma dinamica della fotocamera.
- Flusso in 10 μL di guanilil-(alfa, beta)-metilene-difosfonato (GMPCCP) o microtubuli stabilizzati con taxolo in BRB80 (o particelle d'oro da 40 nm) per perfusione utilizzando una pipetta su un campione fresco e monitorare il legame mediante imaging della superficie. Una volta che 10-20 microtubuli sono legati all'interno del campo visivo, lavare il campione 2 volte con BRB80.
nota: Con un microscopio ben allineato, i microtubuli dovrebbero essere visibili senza sottrazioni di fondo.
- Acquisire 10 immagini impostando un time-lapse con un periodo di ritardo di 1 secondo per 10 secondi (con un'esposizione di 10 ms).
- Acquisisci un'immagine di sfondo. A tale scopo, è possibile spostare il tavolino utilizzando il controller di scena o il software del computer lungo l'asse lungo il canale durante l'acquisizione di 100 immagini senza ritardi (ad esempio, con streaming vicino a 100 fps @ 10 ms di esposizione).
nota: Lo sfondo è la mediana delle 100 immagini. Prendendo la mediana, il profilo di illuminazione e altre caratteristiche fisse come lo sporco sull'ottica vengono preservati mentre tutto il resto viene filtrato. Non ci dovrebbe essere alcuna inclinazione sul campione in quanto ciò porterà a un cambiamento nella posizione assiale quando il tavolino viene spostato e, in ultima analisi, degraderà l'immagine di sfondo. Se l'inclinazione non può essere evitata, un metodo alternativo consiste nell'acquisire immagini di sfondo medie prima di far scorrere i semi.
- Per l'elaborazione e l'analisi delle immagini, andare al passaggio 6.
5. Imaging della dinamica dei microtubuli
- Per la dinamica dei microtubuli con la tubbulina cerebrale, impostare la temperatura del riscaldatore del campione a 37 °C.
- Fluire in 10 μL di semi di microtubuli stabilizzati con GMPCCP in BRB80 per perfusione utilizzando una pipetta su un campione fresco e monitorarli mentre si legano alla superficie mediante imaging della superficie dal vivo (cioè durante lo streaming). Una volta che 10-20 semi sono legati con il campo visivo, lavare il campione utilizzando 2x volume di canale con BRB80 (BRB80 deve essere preriscaldato a 37 °C o almeno a temperatura ambiente).
nota: Con un microscopio ben allineato, i semi dovrebbero essere visibili senza sottrazione di sfondo.
- Flusso nella miscela di polimerizzazione (7,5 μM di tubulina non marcata + 1 mM di guanosina trifosfato (GTP) + 1 mM di ditiotreitolo (DTT) in tampone BRB80). Per misurare la crescita dei microtubuli, impostare un time-lapse utilizzando il software di acquisizione per acquisire un'immagine ogni 5 secondi (0,2 fotogrammi al secondo (fps)) per 15 minuti.
- Per migliorare il contrasto, acquisire 10 immagini (invece di una) in ogni punto temporale e calcolarne la media. Per il restringimento dei microtubuli, acquisire immagini a 100 fps impostando il ritardo su 0 e un tempo di esposizione di 10 ms (è possibile ottenere fps più elevati con regioni di interesse più piccole a seconda della fotocamera utilizzata).
- Acquisire un'immagine di sfondo come nel passaggio 4.4.
6. Elaborazione e analisi delle immagini
NOTA: Per l'analisi, questo protocollo utilizza Fiji, ma il lettore è libero di utilizzare qualsiasi software che ritenga adatto.
- Apri le immagini di sfondo salvate.
- Calcola l'immagine mediana (cioè lo sfondo) utilizzando Image > Stack > progetto Z > Mediana.
- Apri il filmato sulle dinamiche dei microtubuli come una pila (lo stesso per i microtubuli non dinamici) utilizzando File > Apri.
- Sottrai l'immagine di sfondo dalla pila utilizzando Elabora > Calcolatore di immagini. Assicurati di selezionare l'opzione "Risultato a 32 bit (float)".
- Per i microtubuli dinamici, utilizzando lo strumento linea tracciare una linea lungo il microtubulo di interesse e aggiungerla al gestore della regione di interesse premendo "t". Ripetere per tutti i microtubuli di interesse.
- Per i microtubuli dinamici, eseguire la macro Multi-Kymo. La macro genererà un video e un chimografo per ogni microtubulo nel gestore del ROI. Ogni microtubulo avrà un identificatore univoco.
- Per i microtubuli dinamici, eseguire la macro Kymo-Analysis e seguire i suoi passaggi per misurare i tassi di crescita e i tassi di restringimento dei microtubuli.
7. Dimensione del diaframma di apertura
NOTA: Un fattore importante per l'acquisizione di immagini ad alto contrasto di microtubuli utilizzando IRM è l'impostazione corretta dell'apertura numerica di illuminazione (INA). L'INA può essere modificato modificando la dimensione del raggio di illuminazione in entrata alla pupilla d'uscita dell'obiettivo, che è controllata dalla dimensione dell'AD (l'AD si trova su un piano coniugato con la pupilla d'uscita (piano focale posteriore) dell'obiettivo, Figura 1):
dove DAD è il diametro del diaframma di apertura, fobjective è la lunghezza focale dell'obiettivo e Dep è il diametro della pupilla di uscita dell'obiettivo. In genere, l'AD viene lasciato completamente aperto per l'imaging a fluorescenza, quindi l'INA è uguale all'NA dell'obiettivo. In un microscopio a fluorescenza, la scala AD non indica il suo diametro, quindi l'INA non può essere calcolato. È possibile calibrare la dimensione dell'AD con l'aiuto di un obiettivo. Tuttavia, non è necessario poiché la dimensione AD verrebbe fissata alla dimensione che produce il contrasto più elevato.
- Preparare un campione di microtubuli stabilizzati marcati in fluorescenza attaccati alla superficie (passaggi 4.1-4.2).
nota: Abbiamo utilizzato microtubuli marcati con tetrametilrodamina (Es: 550 nm, Em: 580 nm).
- Mettere a fuoco i microtubuli utilizzando la manopola di messa a fuoco del microscopio durante l'imaging fluorescente (se i microtubuli non sono etichettati, visualizzarli con IRM o DIC).
- Impostare l'esposizione della fotocamera su 10 ms utilizzando il software della fotocamera.
nota: Questa esposizione è arbitraria e funzionerebbe anche un'esposizione di 100 ms.
- Chiudi l'AD fino alla sua apertura più piccola. Regolare l'illuminazione in modo da saturare quasi completamente la gamma dinamica della fotocamera o al massimo possibile.
nota: Come guida, utilizzare la tabella di ricerca fornita in genere dal software di acquisizione.
- Acquisisci 10 immagini (in streaming o scattando un'immagine al secondo) di un campo visivo contenente 10+ microtubuli.
- Acquisire un'immagine di sfondo come nel passaggio 4.4.
- Modificare la dimensione dell'AD e ripetere i passaggi 7.5-7.6 per l'intero intervallo di apertura dell'AD (dalla dimensione della pupilla chiusa a quella di uscita, Figura 2). Ogni volta che si modifica la dimensione dell'AD regolare l'intensità dell'illuminazione in modo che corrisponda a quella del passaggio 7.4.
- Per ogni campo visivo acquisito, sottrarre lo sfondo corrispondente utilizzando il calcolatore di immagini di processo > e scegliendo "sottrai" dal menu a discesa. Assicurati che l'opzione "Risultato a 32 bit (float)" sia selezionata. Quindi calcola la media delle immagini risultanti utilizzando la pila di immagini > > progetto Z> media.
- Misurare il rapporto segnale/rumore di fondo (SBR) dei microtubuli, definito come l'intensità media del segnale del microtubulo (intensità del microtubulo meno l'intensità del fondo) divisa per la deviazione standard del fondo (Figura 3).
- Determinare la dimensione ottimale dell'AD (cioè l'INA ottimale) calcolando l'SBR medio dei microtubuli per ogni dimensione di apertura e impostare la dimensione dell'AD su quella che produce l'SBR più alto (Figura 2). È possibile che esista una gamma di dimensioni AD che producono un contrasto comparabile.
