Microscopia a riflessione interferenziale per la visualizzazione senza marcatura della dinamica dei microtubuli

Abstract

Fonte: Mahamdeh, M., et al. Implementazione della microscopia a riflessione interferenziale per l'imaging ad alta velocità e senza marcatura di microtubuli. J. Vis. Exp. (2019).

In questo video, descriviamo la tecnica di microscopia a riflessione per interferenza (IRM) per visualizzare i microtubuli che crescono sulla superficie di un vetrino coprioggetti in presenza di un tampone adatto. Dopo l'illuminazione con luce incidente, l'interfaccia vetrino-tampone e l'interfaccia tampone-microtubuli riflettono la luce, che si combina per creare un modello di interferenza, consentendo la visualizzazione dei microtubuli come immagini ad alto contrasto su uno sfondo luminoso.

Protocol

1. Modifica del microscopio e dell'obiettivo

1. Inserire uno specchio 50/50 nella ruota portafiltri del microscopio a fluorescenza utilizzando un cubo filtrante appropriato (Figura 1). Maneggiare lo specchio 50/50 con cura poiché spesso hanno un rivestimento antiriflesso.
   nota: Abbiamo usato uno specchio 50/50 in un cubo filtrante vuoto del microscopio. Lo specchio 50/50 viene inserito dove si trova lo specchio dicroico.
2. Utilizzare un obiettivo a olio ad alto ingrandimento/alta apertura numerica (NA).
   nota: In questo protocollo, abbiamo utilizzato un obiettivo 100x/1.3 NA.....

Results

Figura 1. Rappresentazione schematica di IRM. (A) L'epi-illuminazione della sorgente luminosa passa attraverso il diaframma di apertura prima di raggiungere lo specchio 50/50. Il diaframma di apertura imposta l'ampiezza del fascio e quindi l'illuminazione NA. Lo specchio 50/50 riflette parzialmente la luce fino all'obiettivo per illuminare il campione. La luce riflessa dal campione viene raccolta e quindi proiettata sul chip della f.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscopio	Nikon	Ti-Eclipse	Un microscopio invertito utilizzato per eseguire gli expriments
Divisore di fascio 50/50	Chroma	21000	Al momento dell'acquisto, assicurati di scegliere le dimensioni dello splitter che si adattano al cubo utilizzato nel microscopio
Obiettivo a iride NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3	Nikon	MRH02902	Obiettivo di imaging. Questo obiettivo ha un diaframma di regolazione NA che è stato aperto a NA 1.3
Detergente universale Mucasol	Sigma-Aldrich	Z637181-2L	Utilizzato per la pulizia di vetrini coprioggetti e vetrini
Film plastico di paraffina (nome commerciale Parafilm M)	Sigma-Aldrich	P7793	Utilizzato per la costruzione di canali di flusso
Anticorpo anti-TAMRA	Invitrogen	A-6397	Utilizzato per legare molecole marcate con TAMBRA (ad es. microtubuli) alla superficie del campione. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (nome commerciale Pluronic F-127)	Sigma-Aldrich		Utilizzato per bloccare la superficie del canale per evitare un legame non specifico
Nanoparticelle d'oro da 40 nm	Sigma-Aldrich	753637	Utilizzato come campione di controllo
Nanoparticelle d'oro da 20 nm	Sigma-Aldrich	Codice 753610	Utilizzato come campione di controllo
Zyla 4.2 Fotocamera	Andor	Zyla 4.2	2048x2048 pixel (dimensione pixel 6,5μm) con efficienza quantica del 72% e gamma dinamica a 16 bit
Software di tracciamento Feista			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
Microtubuli stabilizzati			Preparato in casa (vedi riferimenti nel testo)