Microscopia statica a forza atomica per visualizzare e caratterizzare nucleosomi assemblati

Abstract

Fonte: Stormberg, T., et al. Sondare la struttura e la dinamica dei nucleosomi utilizzando l'imaging al microscopio a forza atomica. J. Vis. Exp.(2019)

In questo video, dimostriamo la microscopia statica a forza atomica per visualizzare nucleosomi assemblati. Questa tecnica di imaging ad alta risoluzione consente lo studio della struttura del nucleosoma.

Protocol

1. Funzionalizzazione della superficie di mica per l'imaging statico AFM dei nucleosomi

1. Preparare una soluzione madre APS di 50 mM di 1-(3-amminopropil) silatano in acqua deionizzata come descritto. Conservare 1 mL di aliquote di questa soluzione a 4 °C fino al momento dell'uso.
   nota: Le aliquote possono essere conservate per più di un anno a 4 °C.
2. Preparare una soluzione APS 1:300 funzionante per la modifica della mica sciogliendo 50 μL del materiale da 50 mM APS in 15 mL dd H₂O.
   nota: Questa soluzione di lavoro può essere conservata a temperatura ambiente per diversi gi....

Results

Figura 1: Schema del processo per preparare la mica funzionalizzata con APS per l'imaging AFM dei nucleosomi. (A) un pezzo di mica di ~0,1 mm di spessore ha entrambi i lati appena tagliati. (B) Il pezzo di mica scisso viene prontamente posizionato diagonalmente in una cuvetta contenente la soluzione APS e viene impostato per incubare per 30 minuti. (C) Dopo la fase di funzionalizzazione dell'APS, il pezzo di mica AP.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CENP-A/H4)2, ricombinante umano	Epicypher, Durham, Carolina del Nord	16-0010	Numero di catalogo per 50 ug
H2A/H2B, umano ricombinante	Epicypher, Durham, Carolina del Nord	Codice 15-0311	Numero di catalogo per 50 ug
H3 Octamer, umano ricombinante	Epicypher, Durham, Carolina del Nord	16-0001	Numero di catalogo per 50 ug
Kit di dispositivi per dialisi Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Codice 69574	Numero di catalogo per 10 dispositivi
cloruro di sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Numero di catalogo per 500 mg
Filtri centrifughi Amicon Ultra-0,5 mL	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Numero di catalogo per 8 dispositivi
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Numero di catalogo per 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Numero di catalogo per 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Numero di catalogo per 1 kg
Persolfato di ammonio (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	Codice 1610700	Numero di catalogo per 10 g
Soluzione di acrilammide/bis al 30%, 37,5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Numero di catalogo per 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	Codice 1610800	Numero di catalogo per 5 mL
4x tampone per campioni di proteina Laemmli per SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	Numero di catalogo per 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Numero di catalogo per 10 mL
ageRuler Scala proteica prestained	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Codice 26616	Numero di catalogo per 500 uL
Macchia di Coomassie bio-sicura™	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Numero di catalogo per 1 L
Salviette in tessuto non tessuto per camere bianche: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Carolina del Nord	Trasmissione TX604
Blocco di mica moscovita	AshevilleMica, Newport News, VA	Grado-1
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Numero di catalogo per 25 g
Nastro adesivo	Scotch-3M, San Paolo, MN
Sonda afm TESPA-V2 (per imaging statico)	Sonde AFM Bruker, Camarillo, CA
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Numero di catalogo per 10 dispositivi
BL-AC10DS-A2 sonda afm (per HS-AFM)	Olimpo, Giappone
Microscopio a forza atomica multimodale	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA