Microscopia statica a forza atomica per visualizzare e caratterizzare nucleosomi assemblati

Abstract

Fonte: Stormberg, T., et al. Sondare la struttura e la dinamica dei nucleosomi utilizzando l'imaging al microscopio a forza atomica. J. Vis. Exp.(2019)

In questo video, dimostriamo la microscopia statica a forza atomica per visualizzare nucleosomi assemblati. Questa tecnica di imaging ad alta risoluzione consente lo studio della struttura del nucleosoma.

Protocollo

1. Funzionalizzazione della superficie di mica per l'imaging statico AFM dei nucleosomi

1. Preparare una soluzione madre APS di 50 mM di 1-(3-amminopropil) silatano in acqua deionizzata come descritto. Conservare 1 mL di aliquote di questa soluzione a 4 °C fino al momento dell'uso.
   nota: Le aliquote possono essere conservate per più di un anno a 4 °C.
2. Preparare una soluzione APS 1:300 funzionante per la modifica della mica sciogliendo 50 μL del materiale da 50 mM APS in 15 mL dd H₂O.
   nota: Questa soluzione di lavoro può essere conservata a temperatura ambiente per diversi giorni.
3. Tagliare strisce di mica di 1 x 3 cm da fogli di mica di alta qualità (vedere la tabella dei materiali per la mica utilizzata qui).
   1. Verificare che il pezzo si adatti quando viene posizionato in diagonale in una cuvetta. Usa la punta di una pinzetta affilata, una lama di rasoio o dello scotch per tagliare gli strati di mica fino a quando entrambi i lati non sono appena tagliati e il pezzo è sottile fino a ~0.1 mm (Figura 1A). Posizionare immediatamente il pezzo di mica nella cuvetta riempita di APS e incubare per 30 minuti (Figura 1B).
4. Trasferire il pezzo di mica in una cuvetta riempita con dd H2O e immergere per 30 s (Figura 1C). Asciugare completamente entrambi i lati della striscia di mica APS sotto un flusso di argon.
   nota: È possibile utilizzare una salvietta per camera bianca in tessuto non tessuto di cellulosa e poliestere (si consiglia di specificare i materiali) per favorire l'evacuazione dell'acqua dal bordo della mica durante l'asciugatura.
5. Utilizzare ora la striscia di mica secca per la preparazione del campione. In caso contrario, conservare il pezzo in una cuvetta pulita e asciutta (Figura 1D).
   nota: Si consiglia un'ulteriore conservazione nel vuoto per 1-2 ore quando l'ambiente è umido. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Preparazione di campioni di nucleosoma su APS-Mica per l'imaging AFM statico

1. Applicare del nastro biadesivo su diversi dischi magnetici e posizionarli lateralmente.
2. Tagliare il substrato di mica APS alla dimensione desiderata (quadrati da 1 x 1 cm per lo strumento MM AFM utilizzato qui). Metti questi pezzi in una capsula di Petri pulita e tienili coperti.
3. Preparare tre diluizioni dei nucleosomi assemblati (concentrazioni finali del nucleosoma di 0,5, 1,0 e 2,0 nM) utilizzando un tampone filtrato da 0,22 μm contenente 10 mM di HEPES pH 7,5 e 4 mM di MgCl₂,
   nota: Per limitare la perdita di nucleosomi alla bassa concentrazione finale, le diluizioni devono essere effettuate una alla volta, immediatamente prima della deposizione sulla APS-mica.
4. Depositare 5-10 μL del campione di nucleosoma diluito al centro del pezzo di mica APS e lasciarlo incubare per due minuti. Sciacquare delicatamente il campione con 2-3 mL di dd H₂O per rimuovere tutti i componenti del tampone. Dopo aver utilizzato ogni ~0,5 ml di dd H₂O, agitare delicatamente la mica per rimuovere l'acqua di risciacquo in eccesso.
   nota: Per questa fase di risciacquo si consiglia una siringa monouso.
5. Asciugare il campione depositato sotto un leggero flusso di gas argon pulito.
   nota: Il campione è ora pronto per essere sottoposto a imaging o può essere conservato in un armadio a vuoto o in un essiccatore riempito di argon. I campioni preparati e conservati come descritto sono stati sottoposti a imaging un anno dopo la preparazione senza perdita di qualità. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. Imaging AFM statico dei nucleosomi

1. Montare una punta AFM sul supporto della punta. Utilizzare una punta che abbia una costante elastica di ~40 N/m e una frequenza di risonanza compresa tra 300 e 340 kHz (vedere la Tabella dei materiali per i cantilever utilizzati qui).
2. Montare il campione preparato nella sezione 3 sullo stadio AFM facendo attenzione a non toccare la superficie del campione.
3. Posizionare il laser sul cantilever fino a quando la somma non è al massimo e regolare i valori di deflessione verticale e laterale quasi a zero.
4. Sintonizza la sonda AFM per trovare la sua frequenza di risonanza e regola l'ampiezza dell'unità e imposta la dimensione dell'immagine su 100 x 100 nm. Fare clic sul pulsante di attivazione per iniziare l'approccio.
5. Una volta avvicinato, ottimizzare gradualmente il setpoint di ampiezza fino a quando la superficie del campione non è chiaramente visibile. Aumentare le dimensioni di scansione a 1 x 1 μm e la risoluzione a 512 x 512 pixel. Fare clic sul pulsante di acquisizione seguito dal pulsante di attivazione per avviare l'acquisizione dell'immagine.
   nota: Le immagini nella Figura 2 mostrano lo sfondo uniforme che ci si può aspettare quando si esegue l'imaging di questi campioni.

Risultati

Figura 1: Schema del processo per preparare la mica funzionalizzata con APS per l'imaging AFM dei nucleosomi. (A) un pezzo di mica di ~0,1 mm di spessore ha entrambi i lati appena tagliati. (B) Il pezzo di mica scisso viene prontamente posizionato diagonalmente in una cuvetta contenente la soluzione APS e viene impostato per incubare per 30 minuti. (C) Dopo la fase di funzionalizzazione dell'APS, il pezzo di mica AP...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CENP-A/H4)2, ricombinante umano	Epicypher, Durham, Carolina del Nord	16-0010	Numero di catalogo per 50 ug
H2A/H2B, umano ricombinante	Epicypher, Durham, Carolina del Nord	Codice 15-0311	Numero di catalogo per 50 ug
H3 Octamer, umano ricombinante	Epicypher, Durham, Carolina del Nord	16-0001	Numero di catalogo per 50 ug
Kit di dispositivi per dialisi Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Codice 69574	Numero di catalogo per 10 dispositivi
cloruro di sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Numero di catalogo per 500 mg
Filtri centrifughi Amicon Ultra-0,5 mL	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Numero di catalogo per 8 dispositivi
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Numero di catalogo per 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Numero di catalogo per 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Numero di catalogo per 1 kg
Persolfato di ammonio (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	Codice 1610700	Numero di catalogo per 10 g
Soluzione di acrilammide/bis al 30%, 37,5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Numero di catalogo per 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	Codice 1610800	Numero di catalogo per 5 mL
4x tampone per campioni di proteina Laemmli per SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	Numero di catalogo per 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Numero di catalogo per 10 mL
ageRuler Scala proteica prestained	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Codice 26616	Numero di catalogo per 500 uL
Macchia di Coomassie bio-sicura™	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Numero di catalogo per 1 L
Salviette in tessuto non tessuto per camere bianche: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Carolina del Nord	Trasmissione TX604
Blocco di mica moscovita	AshevilleMica, Newport News, VA	Grado-1
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Numero di catalogo per 25 g
Nastro adesivo	Scotch-3M, San Paolo, MN
Sonda afm TESPA-V2 (per imaging statico)	Sonde AFM Bruker, Camarillo, CA
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Numero di catalogo per 10 dispositivi
BL-AC10DS-A2 sonda afm (per HS-AFM)	Olimpo, Giappone
Microscopio a forza atomica multimodale	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA