Microscopia a forza atomica time-lapse ad alta velocità per catturare la dinamica dei nucleosomi

Abstract

Fonte: Stumme-Diers, M. P., et al., Sondare la struttura e la dinamica dei nucleosomi utilizzando l'imaging al microscopio a forza atomica.J. Vis. Exp.(2019)

In questo video, dimostriamo tecniche di imaging ad alta velocità di microscopia a forza atomica time-lapse, AFM, per studiare la dinamica dei complessi nucleosomici. Mentre la punta AFM scansiona la superficie del nucleosoma, rileva alterazioni nell'altezza del nucleosoma e registra lo srotolamento del DNA nel tempo.

Protocollo

1. Assemblaggio a diluizione continua di mononucleosomi

1. Generare e purificare un substrato di DNA di circa 400 bp che contiene una sequenza di posizionamento del nucleosoma Widom 601 decentrata.
   nota: Per limitare la formazione indesiderata di dinucleosomi, ogni "braccio" che fiancheggia la sequenza di posizionamento non deve superare ~150 bp.
   1. Utilizzare il plasmide pGEM3Z-601 insieme ai primer progettati e amplificare il DNA del substrato utilizzando la PCR. Per il substrato da 423 bp con lunghezze del braccio di 122 e 154 bp utilizzato qui, utilizzare primer in avanti (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') e inverso (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3').
   2. Aggiungere i tubi contenenti la miscela di reazione a un termociclatore preriscaldato a 95 °C. Eseguire il seguente programma per 33 cicli dopo una denaturazione iniziale per 5 minuti a 95 °C: denaturazione di 30 s a 95 °C, ricottura di 30 s a 49 °C e prolunga di 35 s a 72 °C. Impostare un'estensione finale a 72 °C per 10 minuti dopo i 33 cicli.
   3. Purificare il DNA dalla miscela PCR utilizzando un kit di purificazione PCR disponibile in commercio. Quando si eluisce il DNA dalla colonna di pulizia PCR, utilizzare 10 mM di tampone Tris (pH 7,5) al posto del tampone di eluizione fornito dal kit.
      nota: Prestare particolare attenzione a non trasferire i tamponi tra le fasi di purificazione. Un eluente contaminato può causare problemi a valle durante la misurazione della concentrazione di DNA e/o può alterare la concentrazione iniziale di sale della miscela di assemblaggio del nucleosoma.
2. Determinare la concentrazione di DNA misurando l'assorbanza del DNA purificato a 260 nm.
   1. Raccogliere uno spazio vuoto sullo spettrofotometro UV VIS utilizzando solo il tampone di eluizione Tris pH 7.5 da 10 mM. Raccogli una misurazione del DNA purificato.
3. Una volta determinata la concentrazione, aliquotare 25 pmol di DNA purificato in una provetta per microfuge da 0,6 mL e metterla in una centrifuga sottovuoto fino a quando la soluzione è appena visibile; questo è tipicamente da 30 minuti a 1 h.
   nota: Il substrato del DNA è ora pronto per l'assemblaggio del nucleosoma. In caso contrario, il protocollo può essere messo in pausa e il DNA può essere conservato a -20 °C fino all'uso.
4. Posizionare il tubo per microfugi contenente il DNA da 25 pmol sul ghiaccio e aggiungere i componenti dell'assemblaggio del nucleosoma nella Tabella 1, nell'ordine elencato. Quando tutti i componenti sono stati aggiunti, rimuovere la miscela dal ghiaccio e incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 min.
   nota: È fondamentale che il contenuto di sale del tampone istonico stock sia considerato quando si calcola il NaCl necessario per raggiungere la concentrazione finale di 2 M.
5. Assemblare i nucleosomi riducendo la concentrazione di sale 2 M della miscela a 200 mM utilizzando una diluizione a velocità continua.
   1. Riempire una siringa con 100 μL di tampone di diluizione contenente 10 mM di Tris pH 7,5 e posizionarla su una pompa a siringa.
   2. Dirigere l'ago della siringa attraverso un foro pre-perforato nel tappo del tubo per microfuge, assicurandosi che il contatto avvenga con la miscela di assemblaggio (Figura 1).
   3. Far funzionare la pompa a siringa a una velocità di 0,75 μl/min per 120 min.
      nota: La soluzione da 100 μL risultante contiene 250 nucleosomi nM e 200 mM di NaCl.
   4. Trasferire la miscela in un bottone di dialisi MWCO da 10 K e dializzare con 200 mL di un tampone a basso contenuto di sale pre-raffreddato (4 °C) contenente 10 mM di Tris pH 7,5, 0,25 mM EDTA e 2,5 mM di NaCl, per 1 ora a 4 °C.
6. Per valutare il contenuto istonico dell'assemblaggio del nucleosoma, preparare un gel SDS-PAGE discontinuo con una separazione del 15% e un impilamento del 6% come descritto in precedenza.
   1. Aliquotare 10 - 20 μl dello stock di nucleosomi in una provetta per microfuge e aggiungere 4x Laemmli Sample Buffer a una concentrazione di lavoro di 1 - 2x.
   2. Come controllo, ripetere questa preparazione in una provetta per microfuge separata per 1 - 2 μg di stock istonico. Riscaldare i campioni a 95 °C per ~ 5 min.
   3. Caricare i campioni in corsie adiacenti l'uno all'altro sul gel. Aggiungere un buffer di campionamento alle corsie inutilizzate per favorire una migrazione uniforme della banda.
   4. Far scorrere il gel a 65 V fino a quando la parte anteriore del colorante non si muove attraverso il gel di impilamento. Quando il gel separatore viene raggiunto, aumentarlo a 150 V e farlo scorrere fino a quando il fronte del colorante non è completamente migrato fuori dal gel.
   5. Smontare l'unità di elettroforesi e trasferire delicatamente il gel in un contenitore per la colorazione riempito con dd H₂O. Lasciare riposare il gel per 5 minuti con una leggera agitazione. Ripetere questo processo altre due volte con dd fresco H₂O usato ogni volta.
      nota: Il colorante Coomassie utilizzato in questo protocollo non richiede le tipiche fasi di fissaggio necessarie per i coloranti Coomassie (vedi Tabella dei materiali). Se si utilizza un altro preparato Coomassie, regolare le fasi di fissaggio secondo necessità.
   6. Rimuovi l'acqua dall'ultimo risciacquo e aggiungi la macchia quanto basta per coprire il gel. Lasciare riposare il gel agitando delicatamente per almeno 1 ora < / > nota: Per l'agitazione, il contenitore per la colorazione può essere posizionato su qualsiasi apparecchio che favorisca il movimento della macchia sul gel mantenendo anche il gel coperto di liquido.
   7. Rimuovere la macchia dal contenitore e sciacquare il gel con dd H₂O. Sostituire il dd H₂O e immergere il gel per 30 minuti agitando delicatamente. (Il gel dovrebbe apparire come quello mostrato nella Figura 2, con una netta separazione delle bande istoniche.)
7. Conservare i nucleosomi a 4 °C fino al momento dell'uso.
   nota: Se conservati in queste condizioni, i nucleosomi rimangono stabili per diversi mesi. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Imaging AFM time-lapse ad alta velocità della dinamica dei nucleosomi

NOTA: Il protocollo seguente è fornito per lo strumento HS-AFM sviluppato dal gruppo Ando (Università di Kanazawa, Kanazawa, Giappone).

1. Preparare l'APS-mica per l'imaging dei liquidi.
   1. Fissare l'asta di vetro allo stadio dello scanner AFM utilizzando la colla per scanner ad asta di vetro (vedi Tabella dei materiali). Lasciate asciugare per un minimo di 10 minuti.
   2. Crea pezzi circolari di mica spessi ~0,1 mm con un diametro di 1,5 mm perforandoli da un foglio di mica più grande. Utilizzare la colla per bacchette di mica-vetro HS-AFM (vedi Tabella dei materiali) per attaccare questo pezzo di mica all'asta di vetro sull'HS-AFM e asciugare, senza toccarla per un minimo di 10 minuti. Tagliare gli strati con un nastro adesivo sensibile alla pressione fino a quando non si vede uno strato ben tagliato sul nastro.
   3. Diluire 1 μL di 50 mM di stock APS in 99 μL di dd H₂O per ottenere una soluzione APS da 500 μM. Depositare 2,5 μL di questa soluzione sulla superficie di mica appena scissa e lasciare funzionalizzare per 30 min.
      nota: Per evitare l'essiccazione della superficie durante la funzionalizzazione, il tappo di una provetta da centrifuga conica da 50 ml può essere inserito con un pezzo di carta da filtro umido e posizionato sopra lo scanner. Il materiale APS è diluito 3 volte meno per l'imaging liquido rispetto all'imaging statico per controllare la dinamica a una velocità che può essere osservata con l'AFM.
   4. Sciacquare la mica con 20 μL di dd H₂O applicando diversi risciacqui da ~3 μL. Rimuovere completamente l'acqua dopo ogni risciacquo posizionando una salvietta in tessuto non tessuto sul bordo della mica. Dopo l'ultimo risciacquo, posizionare ~3 μL di dd H₂O sulla superficie e lasciare riposare per un minimo di 5 minuti per rimuovere eventuali APS non specificamente legati.
2. Posizionare la sonda nel supporto HS-AFM e posizionare il supporto sul tavolino AFM con la punta rivolta verso l'alto. Sciacquare il supporto utilizzando ~100 μL di dd H₂O seguiti da due risciacqui da ~100 μL di tampone di imaging nucleosomi filtrato da 0,22 μm che contiene 10 mM HEPES pH 7,5 e 4 mM MgCl₂.
3. Al termine dei risciacqui, riempire la camera con ~100 μL di tampone per l'imaging del nucleosoma, immergendo la punta. Regolare la posizione del cantilever fino a quando non viene colpita dal laser. Sciacquare la mica APS con 20 μL di tampone filtrato per l'imaging del nucleosoma, utilizzando ~4 μL per risciacquo.
4. Diluire 1 μL dello stock di assemblaggio del nucleosoma in 250 μL di tampone filtrato per l'imaging del nucleosoma per una concentrazione finale del nucleosoma di 1 nM. Depositare 2,5 μL di questa diluizione sulla superficie e lasciarla riposare per 2 minuti. Sciacquare la superficie con ~ 4 μL di tampone per l'imaging del nucleosoma due volte. Dopo l'ultimo risciacquo, lasciare la superficie coperta nel tampone di imaging.
   nota: Se la superficie non viene risciacquata dopo aver depositato il campione di nucleosoma, la superficie diventerà rapidamente sovraffollata.
5. Posizionare lo scanner e il campione sopra il supporto della punta in modo che il campione sia rivolto verso il basso. Per iniziare l'avvicinamento, utilizzare la funzione di avvicinamento automatico con un'ampiezza del set point, A_s vicina all'ampiezza dell'oscillazione libera A₀.
   nota: Idealmente, A_s = 0,95 A₀, tuttavia, operando all'82% di A₀ funzionerà altrettanto bene se si fa attenzione.
6. Regolare il punto di regolazione fino a quando la superficie non è ben tracciata.
   nota: Per ridurre al minimo il trasferimento di energia dalla punta dell'AFM al campione di nucleosoma, l'ampiezza del cantilever deve essere mantenuta piccola, con ampiezze ottimali fino a 1 nm.
7. Impostare l'area dell'immagine tra 150 x 150 nm e 200 x 200 nm con una velocità di acquisizione dati di ~300 ms per fotogramma di imaging.
   nota: Questa dimensione dell'immagine è in genere sufficiente per catturare la dinamica di diversi nucleosomi contemporaneamente. Una superficie meno popolata può richiedere modifiche a questi parametri. Il frame rate suggerito è sufficiente per catturare le dinamiche dei nucleosomi come il looping, lo sliding e l'unwrapping, tra gli altri (vedere la sezione Risultati rappresentativi di seguito).

Tabella 1: Reagenti necessari per l'assemblaggio continuo del nucleosoma a gradiente salino. Ciascuno dei componenti elencati viene aggiunto al tubo di microfuga contenente il DNA purificato. Questo deve essere fatto nell'ordine in cui i reagenti sono elencati nella tabella, con l'aggiunta di acqua e NaCl per primi, seguiti dal dimero H2A/H2B e dal tetramero istonico aggiunto per ultimo. Se si devono utilizzare ottameri istonici pre-piegati, aggiungerli allo stesso rapporto del tetramero sopra. *Prendere nota del contenuto di NaCl in ciascuno dei ceppi istonici e regolare il NaCl 5M per aggiungere di conseguenza, il [NaCl] finale dovrebbe essere uguale a 2M. (Vedi Tabella dei Materiali).

Risultati

Figura 1: Schema della pompa a siringa utilizzata per l'assemblaggio dei nucleosomi su microscala.La miscela di assemblaggio è posizionata in modo da essere a contatto con l'estremità dell'ago della siringa. Quando il tampone di diluizione viene erogato dalla pompa a siringa alla miscela di assemblaggio, la concentrazione di NaCl diminuisce, favorendo l'assemblaggio dei nucleosomi. Questa figura è adattata da Stumme-Diers et al<...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Plasmide pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	Codice 26656
Primer per PCR	IDT, Coralville, IA	Ordine personalizzato	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polimerasi	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Numero di catalogo per 200 unità
Kit di purificazione PCR	Qiagen, Hilden, Germania	Codice 28104	Numero di catalogo per 50 unità
Base tris	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Numero di catalogo per 250 g
Edta	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Numero di catalogo per 500 g
(CENP-A/H4)2, ricombinante umano	Epicypher, Durham, Carolina del Nord	16-0010	Numero di catalogo per 50 ug
H2A/H2B, umano ricombinante	Epicypher, Durham, Carolina del Nord	Codice 15-0311	Numero di catalogo per 50 ug
H3 Octamer, umano ricombinante	Epicypher, Durham, Carolina del Nord	16-0001	Numero di catalogo per 50 ug
Kit di dispositivi per dialisi Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Codice 69574	Numero di catalogo per 10 dispositivi
cloruro di sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Numero di catalogo per 500 mg
Filtri centrifughi Amicon Ultra-0,5 mL	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Numero di catalogo per 8 dispositivi
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Numero di catalogo per 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Numero di catalogo per 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Numero di catalogo per 1 kg
Persolfato di ammonio (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	Codice 1610700	Numero di catalogo per 10 g
Soluzione di acrilammide/bis al 30%, 37,5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Numero di catalogo per 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	Codice 1610800	Numero di catalogo per 5 mL
4x tampone per campioni di proteina Laemmli per SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	Numero di catalogo per 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Numero di catalogo per 10 mL
PageRuler Scala delle proteine prestained	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Codice 26616	Numero di catalogo per 500 uL
Macchia di Coomassie bio-sicura™	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Numero di catalogo per 1 L
Salviette in tessuto non tessuto per camere bianche: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Carolina del Nord	Trasmissione TX604
Blocco di mica moscovita	AshevilleMica, Newport News, VA	Grado-1
Aminopropil silatrane (APS)	Sintetizzato come descritto in 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Numero di catalogo per 25 g
Nastro adesivo	Scotch-3M, San Paolo, MN
Colla Krazy industriale Aron Alpha	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	Numero di catalogo per tubo da 2 g
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Codice: M8266-100G	Numero di catalogo per 100 g
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Numero di catalogo per 10 dispositivi
BL-AC10DS-A2 sonda afm (per HS-AFM)	Olimpo, Giappone
Composto FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Giappone
Composto FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Giappone
Microscopia a forza atomica time-lapse ad alta velocità	Toshio Ando, Istituto di Scienze della Nanovita, Università di Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Giappone