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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale
1. Fissazione primaria, post-fissazione, inclusione, sezionamento e contrasto
- Preparare 1,6 mL di soluzione fissativa primaria (glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,3)) in una provetta per microcentrifugazione da 2 mL. Conservarlo a 5 °C per un massimo di 14 giorni.
- Dalla biopsia muscolare o dall'intero muscolo, isolare un piccolo campione, che ha un diametro massimo di 1 mm in qualsiasi direzione ed è un po' più lungo nella direzione della fibra longitudinale rispetto alla sezione trasversale (ai fini dell'orientamento).
- Posizionare il campione nella provetta contenente la soluzione fredda di fissazione primaria. Conservare a 5 °C per 24 ore.
- Lavare il campione quattro volte (15 minuti tra ogni lavaggio) in tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,3). Utilizzando le pipette di trasferimento, rimuovere il tampone usato dalla provetta lasciando intatto il campione e successivamente aggiungere il tampone fresco.
nota: Dopo il lavaggio finale, il campione può essere conservato nel tampone di cacodilato di sodio 0,1 M a 5 °C per diversi mesi. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
- Postfix con tetrossido di osmio all'1% (OsO4) e ferrocianuro di potassio all'1,5% (K4Fe(CN)6) in tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,3) per 120 minuti a 4 °C.
nota: L'uso di ferrocianuro di potassio all'1,5% (K4Fe(CN)6) è essenziale per un contrasto ottimale delle particelle di glicogeno.
- Sciacquare due volte in acqua bidistillata a temperatura ambiente (RT).
- Disidratare immergendolo in una serie graduata di alcol (etanolo) a RT utilizzando le seguenti concentrazioni: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) e 100% (10 min).
nota: In ogni fase, il campione viene immerso nell'etanolo, che viene successivamente rimosso solo parzialmente per evitare l'essiccazione del campione. Infine, l'etanolo rimanente viene scartato.
- Infiltrato con miscele graduate di ossido di propilene e resina epossidica a RT utilizzando i seguenti rapporti di volume (ossido di propilene/resina epossidica): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (durante la notte). Il giorno seguente, incorporare i campioni in resina epossidica fresca al 100% negli stampi e polimerizzare a 60 °C per 48 ore.
- Tagliare sezioni ultrasottili (60-70 nm) di fibre orientate longitudinalmente e raccoglierle su griglie di rame a un foro come segue.
- Montare il blocco di un campione sul supporto dell'ultramicrotomo.
- Tagliare il blocco sulla superficie con una lametta da barba in modo da raggiungere il livello del tessuto.
- Montare un coltello diamantato (ultra cut 45) davanti al campione e allineare la superficie del campione parallelamente al coltello.
- Produrre una sezione semisottile (1 μm) con il coltello diamantato per controllare l'orientamento del campione. Colorare la sezione semisottile con blu di toluidina per l'osservazione con microscopia ottica.
- Taglia ulteriormente il blocco per ridurre l'area di interesse al fine di ottenere sezioni ultrasottili adeguate.
- Taglio di sezioni ultrasottili (60-70 nm) con un secondo coltello diamantato (ultra cut 45).
- Raccogli 1-2 sezioni su griglie di rame a un foro utilizzando un Perfect Loop.
nota: La griglia in rame a un foro ha un unico foro al centro con membrana di supporto Formvar.
- Confrontare le sezioni con l'acetato di uranile e il citrato di piombo immergendo le griglie di cui sopra in una soluzione di acetato di uranile (0,5% in acqua a doppia distillazione) per 20 minuti, quindi in una soluzione di citrato di piombo (1% in acqua a doppia distillazione) per 15 minuti. Lavare le griglie in acqua a doppia distillazione tra e dopo le due macchie.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Imaging
- Accendere il microscopio elettronico a trasmissione (azionato a una tensione di accelerazione di 80 kV), il computer e il software di registrazione delle immagini. Registra immagini digitali con una telecamera CCD digitale a scansione lenta 2 k x 2 k e il software di imaging associato.
- Inserire la griglia con più sezioni nel tavolino del microscopio.
- Vagliare la griglia inizialmente a basso ingrandimento (ad esempio, x100) per determinare la qualità delle sezioni (ad esempio, fori nella membrana di supporto, detriti, ecc.) e scegliere le sezioni di migliore qualità. A basso ingrandimento, determinare la direzione delle fibre muscolari.
- Successivamente, aumentare l'ingrandimento con il raggio centrato su una fibra periferica nella sezione. Focalizzare l'immagine con un ingrandimento superiore a 30 k per garantire un numero sufficiente di dettagli fini nell'immagine, guidati da una trasformazione di Fourier veloce in tempo reale, se disponibile. Infine, registrare le immagini con un tempo di esposizione di 1 s all'ingrandimento desiderato.
- Acquisire un totale di 24 immagini di una fibra selezionata in modo casuale, ovvero 12 immagini dello spazio miofibrillare e 12 immagini dello spazio subsarcolemmale, con un ingrandimento compreso tra 10 k e 40 k. Assicurarsi che le immagini siano distribuite su tutta la lunghezza e la larghezza della fibra in un ordine casuale ma sistematico per ottenere risultati imparziali (Figura 1A).
nota: L'ingrandimento ottimale dipende dalla risoluzione della fotocamera disponibile e dalle dimensioni delle micrografie. L'obiettivo è quello di raggiungere una risoluzione finale, in cui i diametri delle particelle di glicogeno possono essere misurati entro incrementi di 1 nm, e di includere un'area totale della regione miofibrillare di almeno 70 μm2 e una lunghezza totale della fibra di almeno 25 μm distribuita in 12 immagini dello spazio miofibrillare e 12 immagini dello spazio sottosarcolemmale per fibra, rispettivamente. Le 24 immagini per fibra daranno molto probabilmente una precisione (coefficiente di errore) del contenuto volumetrico dei diversi pool di glicogeno tra 0,1 e 0,2 nelle singole fibre dei muscoli scheletrici umani, di ratto e di topi (Figura 2E).
- Ripetere i passaggi 2.4 e 2.5 fino a ottenere un totale di 6-10 fibre. Se necessario, tagliare sezioni aggiuntive (separate da almeno 150 μm per evitare la sovrapposizione di fibre già visualizzate) e ripetere i passaggi 1.9-2.5.
3. Analisi delle immagini
- Importa le immagini in ImageJ facendo clic su File > Apri.
- Imposta la scala globale in modo che corrisponda alle dimensioni originali dell'immagine facendo clic su Analizza > Imposta scala.
- Ingrandisci al 100% facendo clic su Immagine > Ingrandisci >.
- Misurare lo spessore di un disco Z per immagine dello spazio miofibrillare (12 per fibra) utilizzando lo strumento Linea retta dal menu Strumenti (Figura 1D). Calcola lo spessore medio del disco Z di ciascuna delle 6-10 fibre.
- Definisci 2-3 fibre con il disco Z medio più spesso come fibre di tipo 1 e 2-3 fibre con il disco Z medio più sottile come fibre di tipo 2. Ignorare le 2-4 fibre intermedie per ulteriori analisi (Figura 1E).
NOTA: I seguenti passaggi vengono ripetuti per ciascuna delle 4-6 fibre del campione. Le frazioni di volume del glicogeno sono stimate mediante conteggio dei punti. La dimensione delle griglie è scelta per ottenere un'alta precisione soddisfacente delle stime. Questo si ottiene spesso ottenendo 250 colpi, che poi determinano il numero totale di punti necessari e, a sua volta, l'area per punto.
- Utilizzare lo strumento Linea segmentata per misurare la lunghezza della miofibrilla più esterna visibile appena sotto la regione sottosarcolemmale (Figura 2A).
nota: Questa lunghezza è utilizzata per esprimere il glicogeno subsarcolemmale per area superficiale (cioè la lunghezza della miofibrilla più esterna moltiplicata per lo spessore della sezione (60 nm); vedi passaggio 4.5). Pertanto, solo la regione subsarcolemma, che è rappresentata da questa lunghezza, è inclusa nell'analisi.
- Inserire una griglia facendo clic su Strumenti di analisi > > Griglia e impostare l'Area per punto a 32.400 nm2. Contare il numero di colpi entro la lunghezza disponibile nelle 12 immagini subsarcolemmali, dove una croce colpisce il glicogeno subsarcolemmale (Figura 2A). Un colpo è definito come una particella di glicogeno presente nell'angolo in alto a destra di una croce.
- Inserire una griglia facendo clic su Strumenti di analisi > > Griglia e impostare l'area per punto a 160.000 nm2. Contare il numero di colpi nelle 12 immagini miofibrillari, dove una croce colpisce lo spazio intramiofibrillare (Figura 2B).
- Inserire una griglia cliccando su Strumenti di analisi > > Griglia e impostare l'Area per punto a 3.600 nm2. Contare il numero di colpi nelle 12 immagini miofibrillari, dove una croce colpisce il glicogeno intramiofibrillare (Figura 2C).
- Inserire una griglia cliccando su Strumenti di analisi > > Griglia e impostare l'Area per punto a 32.400 nm2. Conta il numero di colpi nelle 12 immagini miofibrillari, dove una croce colpisce il glicogeno intermiofibrillare (Figura 2D).
- Utilizzando lo strumento Linea retta, misurare il diametro di cinque particelle di glicogeno scelte casualmente di ciascuna piscina per ciascuna delle 12 immagini per ottenere una media di 60 particelle per piscina per fibra.
NOTA: La media di 60 particelle copre in gran parte la variazione all'interno della fibra (Figura 2F).
