1. Linea cellulare e coltura cellulare
- Coltiva 264,7 macrofagi RAW nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% (vol/vol) di siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente, 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2. Sostituire i terreni di crescita a giorni alterni.
- Quando le cellule diventano confluenti all'80%, lavare la piastra due volte utilizzando PBS sterile.
- Staccare le cellule aggiungendo 1.000 μl di tripsina-EDTA allo 0,5% e incubare la piastra di coltura cellulare per 3-5 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C.
- Esaminare la piastra al microscopio ottico per confermare la dissociazione cellulare. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura contenente il 10% di FBS per inattivare la tripsina.
- Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere delicatamente le cellule nel terreno di coltura cellulare completo e determinare la conta e la vitalità delle cellule utilizzando la colorazione con Trypan Blue (0,4%).
nota: La vitalità cellulare minima raccomandata per questo esperimento è del >90%.
- Posizionare i vetrini coprioggetti sterili nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti utilizzando una pinza autoclavata. Seminare le cellule su vetrini coprioggetti a una densità di 1 x 106 cellule/mL e incubare la piastra per una notte in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
- Sostituire il terreno di ciascun pozzetto con un terreno completo fresco da 500 μl prima del trattamento. Pretrattare i macrofagi con un mezzo disperdente (DMSO o altri solventi utilizzati per sciogliere l'EIPA) o con l'inibitore della macropinocitosi 5-(N-etil-N-isopropil)-amiloride (EIPA, 25 μM) per 30 minuti.
- Trattare le cellule con veicolo e stimolatori della macropinocitosi per promuovere l'arruffamento della membrana: forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min) e fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min).
nota: Inibitori alternativi [ad es. latruncolina A (1 μM, 30 min) o citocalasina D (1 μM, 30 min)] e stimolatori [ad es. fattore di crescita epidermico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) o fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] della macropinocitosi possono essere utilizzati anche per caratterizzare la macropinocitosi nei macrofagi e in altri tipi di cellule. Le cellule possono richiedere la fame di siero durante la notte prima del trattamento con stimolatori fisiologici della macropinocitosi. È importante notare che le concentrazioni e i tempi di incubazione più efficaci dovranno essere determinati per stimolare la macropinocitosi in altri tipi di cellule.
2. Fissazione SEM
- Dopo il trattamento, aspirare il terreno dai pozzetti e lavare due volte i vetrini coprioggetti con PBS ghiacciato.
- Fissare le cellule (4% paraformaldeide e 2% glutaraldeide in cacodilato di sodio 0,1 M) per 30 minuti a temperatura ambiente, seguita da incubazione notturna nel fissativo a 4 °C.
- Lavare delicatamente e incubare i vetrini coprioggetti con 500 μl dei seguenti reagenti senza disturbare il monostrato cellulare.
- Lavare una volta in cacodilato di sodio 0,1 M e incubare per 15 minuti.
- Lavare due volte con dH2O con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 25% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 50% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 75% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo all'80% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 95% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 100%. Eseguire 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
nota: La sostituzione/sostituzione dei reagenti deve essere effettuata rapidamente per evitare l'essiccazione all'aria delle cellule. I vetrini coprioggetti possono essere lasciati in etanolo al 100% per diversi giorni a 4 °C. Per la conservazione a lungo termine, aggiungere ulteriore etanolo al 100% e coprire i pozzetti con parafilm per evitare l'essiccazione all'aria del campione.
3. Asciugatura del punto critico
- Metti i vetrini coprioggetti in un essiccatore a punti critici e coprili con etanolo al 100%. Premere il pulsante di accensione e aprire il serbatoio di CO2.
- Premere il pulsante Cool per circa 30 s fino a quando la temperatura scende a 0 °C. Premere il pulsante Fill finché non appare una bolla nella finestra della camera.
- Premere il pulsante di spurgo fino a quando l'odore di etanolo dallo scarico di spurgo scompare. Premere nuovamente il pulsante Cool fino a quando la temperatura scende a 0 °C.
- Premere nuovamente i pulsanti Riempimento e Spurgo per spegnerli e chiudere il serbatoio di CO2. Premere nuovamente il pulsante Freddo per spegnerlo e premere il pulsante Riscaldamento.
- Impostare la temperatura a 42 °C e la pressione a 1.200 psi. Una volta che la pressione e la temperatura si sono stabilizzate, premere il pulsante di spurgo per consentire alla pressione di diminuire lentamente.
- Una volta che la pressione della camera raggiunge i 150 psi, premere il pulsante Vent e attendere che la pressione scenda a 0 psi. Spegnere l'asciugatrice a punto critico e rimuovere i vetrini.
- Monta i vetrini coprioggetti su supporti per campioni in alluminio SEM utilizzando linguette adesive al carbonio e soggetti a rivestimento sputter utilizzando oro/palladio in un rivestimento sputter.
- Accendi il pulsante di accensione e attendi che il vuoto raggiunga i 30 mTorr. Sciacquare la camera per rimuovere l'umidità e l'aria spegnendo l'interruttore del gas e ruotando la valvola del gas fine in senso antiorario.
- Una volta che il vuoto aumenta a 200 mTorr, spegnere l'interruttore del gas e attendere che il vuoto raggiunga i 30 mTorr. Ripeti questo passaggio 3 volte.
- Premere il pulsante Timer e regolare la manopola Voltage finché l'indicatore non legge 10 mA. Rimuovere i vetrini coprioggetti rivestiti dalla camera.
nota: Seguire le istruzioni del produttore per eseguire l'essiccazione dei punti critici e il rivestimento sputter del campione.
4. Imaging e quantificazione
- Inserire i vetrini coprioggetti dei campioni nella camera di un microscopio elettronico a scansione. Chiudere la porta e premere il pulsante Evac.
- Aprire il software operativo SEM. Impostare la tensione di accelerazione a 15 kv e la distanza di lavoro a 10 mm.
- Premi il pulsante Coordinate e spostati intorno al controller finché le celle non appaiono al centro dello schermo di osservazione. Impostare l'ingrandimento su 3.500x e acquisire l'immagine del campione facendo clic sul pulsante Foto.
nota: Usa un livello di ingrandimento più elevato (da 8.500x a 16.000x) per mostrare la membrana plasmatica con maggiori dettagli.
