Quantificazione della formazione di increspature della membrana mediante microscopia elettronica a scansione

Abstract

Fonte: Ahn, W. et al., Visualizzazione della formazione di increspature della membrana utilizzando la microscopia elettronica a scansione.J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra la preparazione del campione, la fissazione e l'imaging di una cellula macrofagica che mostra increspature della membrana utilizzando la microscopia elettronica a scansione, SEM. Informazioni dettagliate sulla morfologia e l'organizzazione della membrana sono fondamentali per comprendere le condizioni fisiologiche delle cellule.

Protocol

1. Linea cellulare e coltura cellulare

1. Coltiva 264,7 macrofagi RAW nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% (vol/vol) di siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente, 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO₂. Sostituire i terreni di crescita a giorni alterni.
2. Quando le cellule diventano confluenti all'80%, lavare la piastra due volte utilizzando PBS sterile.
3. Staccare le cellule aggiungendo 1.000 μl di tripsina-EDTA allo 0,5% e incubare la piastra di coltura cellulare per 3-5 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C.....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5% tripsina-EDTA	Gibco	Codice 15400-054
2% Glutaraldeide	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 16320
4% Paraformaldeide	Santa Cruz Biotecnologia	281692
5-(N-etil-N-isopropil)-amiloride	Sigma Scienze della Vita	A3085
Linguette adesive in carbonio	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 77825-09
Dimetilsolfossido	Corning	25-950-CQC
Aquila di Dulbecco modificata media	Cytiva Scienze della vita	SH30022.01
Piastra per coltura cellulare multipozzetto con TC a fondo piatto trasparente Falcon a 24 pozzetti	Falcone	353047
Siero fetale bovino	Gemelli Bio	900-108
Incubatore a CO2 HERAcell 150i	Thermo Fisher Scientifico	51026282
Hummer modello 6.2 sputter coater	Anatech Stati Uniti	Codice: 58565
Microscopio elettronico a scansione JSM-IT500HR
Vetro di copertura del microscopio	Thermo Fisher Scientifico	12-545-82
Penna Streptococco	Gibco	Codice: 15140-122
Phorbol 12-miristato 13-acetato	Millipore Sigma	Codice: 524400
RAW 264.7 macrofago	ATCC	ATCC TIB-71
M-CSF umano ricombinante	Peprotech	300-25
Essiccatore per punti critici Samdri-790	Società di ricerca Tousimis	8778B
Supporti per campioni in alluminio SEM	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 75220
Cacodilato di sodio	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 12300
Soluzione blu di Trypan	Thermo Fisher Scientifico	15250061