Microscopia a fluorescenza intravitale per studiare la formazione di trombi microvascolari

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Predisposizione degli animali

1. Pesare un topo e caricare il rispettivo farmaco (ad esempio, il cannabinoide, 5 mg/kg di peso corporeo (p.c.) in una siringa da insulina. Somministrare il farmaco 30 minuti prima dell'induzione del trombo.
2. Tenendo il collo del topo tra il pollice e l'indice e la coda del topo con il mignolo, allungare l'animale e iniettare il farmaco per via intraperitoneale (ip) nel quadrante inferiore sinistro dell'addome. Rimetti l'animale nella gabbia per 15 minuti.
3. Preparare l'anestesia con ketamina (90 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (25 mg/kg di peso corporeo). 15 minuti prima dell'induzione del trombo, anestetizzare il topo. Metti il topo nella gabbia, tira leggermente la coda e inietta gli anestetici ip con una siringa da insulina.
4. Rimetti il mouse nella gabbia fino all'inizio dell'anestesia. Per verificare un'anestesia sufficiente, pizzicare la coda con una pinza.
5. Caricare 0,05 mL di destrano marcato con isotiocianato di fluoresceina scongelato (FITC-destrano; 5%, 150 kDa) in una siringa da insulina. Durante il riempimento della siringa, assicurarsi che non rimangano bolle d'aria, perché anche piccole bolle d'aria somministrate per via endovenosa (iv) possono essere letali per l'animale.
6. Posizionare il mouse anestetizzato su una piastra riscaldante in posizione rivolta verso il basso. Regolare la piastra riscaldante a 37 °C.
7. Metti un unguento per gli occhi sulla cornea del topo. Disinfettare la pelle e utilizzare strumenti sterili.
8. Cucire due suture di polipropilene 7/0 nel bordo craniale e caudale dell'orecchio destro. Posizionare i punti il più vicino possibile al bordo e il più vicino possibile alla base (Figura 1B).
9. Sposta il mouse in posizione dorsale. Fissare tutte le gambe alla piattaforma in vetro acrilico utilizzando strisce adesive. Agganciare una sutura sotto i denti anteriori e posizionare la testa in dorsiflessione attaccando la sutura al vetro acrilico con strisce adesive.
10. Traslocare l'animale sulla piattaforma sotto lo stereomicroscopio operativo. Usa l'ingrandimento 16X.

2. Preparazione della vena giugulare sinistra e iniezione di FITC-destrano

Nota: Per la microscopia dell'orecchio destro, prepara la vena giugulare sinistra.

1. Usando un bisturi, crea un'incisione di 5 mm nella pelle sul lato sinistro del collo in direzione cranio-caudale. Sezionare il tessuto sottocutaneo con micropinze e microforbici. Sia legare vasi di attraversamento con suture in poliestere 8/0 che con elettrocoagulazione.
2. Libera la vena dalla sua avventizia usando micro pinze e microforbici senza toccare il vaso.
3. Utilizzare la siringa da insulina preparata per l'iniezione del colorante fluorescente. Afferrare con cautela la parete del vaso con le micropinze, senza perforare la vena. Penetrare la parete del vaso disteso con la siringa e iniettare FITC-destrano iv.
4. Arrestare l'emorragia dopo aver prelevato la siringa utilizzando tamponi di cotone. Evitare la contaminazione da sangue e coloranti dell'orecchio.

3. Posizionamento dell'orecchio destro per la microscopia a fluorescenza intravitale

1. Trasferisci l'animale sulla piastra riscaldante su una struttura in vetro acrilico con una fessura per la piastra riscaldante e un piano alto 0,5 cm per posizionare l'orecchio.
2. Fissare l'animale a faccia in giù sulla piastra riscaldante utilizzando strisce adesive. Posizionare la cartilagine relativamente forte e convessa alla base dell'orecchio accanto ai piani dell'orecchio alti 0,5 cm (Figura 1B) in modo che la parte apicale dell'orecchio possa essere posizionata piatta sul piano.
3. Aggiungere una goccia di NaCl 0,9% a temperatura ambiente sul piano di vetro acrilico per posizionare l'orecchio. Posizionare l'orecchio destro, con le suture predisposte sul lato ventrale concavo rivolto verso il basso, sulla goccia di NaCl allo 0,9%. Usando tamponi di cotone, assorbire la goccia di NaCl e lasciare che le forze capillari attacchino il piano dell'orecchio al vetro acrilico.
4. Fissare le suture al vetro acrilico con del nastro adesivo per fissare la posizione dell'orecchio.
5. Aggiungere una goccia di NaCl a temperatura ambiente allo 0,9% sul lato dorsale convesso dell'orecchio. Applicare con cura un vetrino coprioggetti (0,5 cm di diametro) sull'orecchio senza comprimere i vasi basali che entrano nell'orecchio. Utilizzando tamponi di cotone, rimuovere quanto più NaCl possibile da sotto il vetrino coprioggetti per ridurre al minimo la distanza tra il vetrino coprioggetti e i vasi bersaglio dell'orecchio.

4. Microscopia a fluorescenza intravitale e induzione di trombi dell'orecchio destro

1. Regolazione del microscopio a fluorescenza intravitale per la visualizzazione FITC-destrano (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Utilizzare una lampada al mercurio variabile da 100 W come fonte di luce. Consente di collegare una telecamera CCD in bianco e nero ad alta risoluzione a un registratore DVD.
2. Trasferire l'animale sulla lastra acrilica contenente la piastra riscaldante con l'orecchio abdotto fisso sulla scrivania del microscopio a fluorescenza intravitale.
3. Utilizzando un ingrandimento 20X (apertura numerica 20X/0,95) e un'intensità luminosa del 20%, cercare un vaso venoso di 50 - 60 μm di diametro e con un flusso sanguigno anterogrado di 400 - 600 μm/s.
4. Aggiungere una goccia di acqua a temperatura ambiente al vetrino coprioggetti per l'immersione in acqua dell'obiettivo con ingrandimento 63x (apertura numerica 63X/0,95). Utilizzare una siringa con cannula di 1 mm di diametro e posizionare la goccia sull'obiettivo del microscopio. Aggiungere acqua quanto basta per entrare in contatto con il vetrino coprioggetti e l'obiettivo con la goccia d'acqua.
5. Immediatamente dopo l'applicazione della goccia d'acqua, iniziare a registrare il vaso per 20 s con un'intensità luminosa del 20% per la misurazione offline del diametro e del flusso sanguigno.
6. Iniziare l'induzione del trombo 5 minuti dopo l'iniezione di FITC-destrano. A tale scopo, aumentare l'intensità della luce al 100%.
7. Durante l'induzione del trombo, chiudere l'apertura del microscopio per 2 s entro un periodo di 30 s per controllare il flusso sanguigno. In caso di flusso sanguigno persistente, aprire nuovamente l'apertura. In caso di interruzione del flusso sanguigno, osservare il vaso per 30 s.
   nota: Il vaso è classificato come occluso se il flusso rimane fermo per 30 s o più o se il sangue scorre retrogradamente. Se il flusso sanguigno ortogrado ricomincia, aprire completamente l'apertura e continuare l'induzione del trombo fino a quando non si verifica l'occlusione del vaso come descritto sopra. Durante l'induzione precoce del trombo, assicurarsi che i tempi in cui l'apertura è stata chiusa per controllare il flusso sanguigno siano i più brevi possibili al fine di mantenere un'epiilluminazione quasi continua. Successivamente, durante la crescita del trombo, il vaso viene perfuso con un colorante meno fluorescente, in modo che possa essere osservato continuamente.
8. Selezionare e occludere 5 vasi per orecchio. Limitare il tempo di induzione del trombo al microscopio a circa 1 ora dopo l'iniezione di FITC-destrano.

Figura 1. Preparazione della vena giugulare (A) e posizionamento dell'orecchio per la microscopia intravitale (B). (A) Utilizzando lo stereomicroscopio operativo, viene preparata la vena giugulare destra. Le suture per il posizionamento dell'orecchio sinistro vengono suturate prima dell'iniezione di FITC-destrano. La ferita della precedente dissezione della vena giugulare sinistra viene chiusa con suture transcutanee (B). L'orecchio sinistro è fissato con suture in polipropilene 7/0. Un vetrino coprioggetti viene posizionato con cura senza comprimere i vasi basali dell'orecchio. Una piastra riscaldante mantiene la temperatura corporea dell'animale durante l'intero esperimento.