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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Preparazione delle citospine
- Preparare due cytospin con cellule mononucleate dei campioni del paziente (cioè un cytospin per la colorazione in immunofluorescenza γH2AX e un cytospin per la colorazione combinata in immunofluorescenza γH2AX e 53BP1) mediante centrifugazione (300 x g, 10 min) di 1,0 x 105 cellule per ciascuna preparazione (Figura 1 e 2).
2. Colorazione in immunofluorescenza γH2AX e 53BP1
- Fissazione e permeabilizzazione: Fissare le cellule con 200 μL di PFA al 4% per 10 minuti. Dopo la fissazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 ml di PBS per 5 minuti ciascuna su un agitatore da laboratorio. Quindi permeabilizzare le cellule con 200 μL di Octoxinol 9 allo 0,1% per 10 minuti. Lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 ml di soluzione bloccante al 5% per 5 minuti ciascuna su un agitatore da laboratorio. Bloccare le cellule in 30 mL di soluzione bloccante fresca al 5% per 1 ora.
- Incubazione con anticorpi
- Incubare una preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale di topo anti-γH2AX (1:500) e l'altra preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale di topo anti-γH2AX (1:500) e un anticorpo policlonale di coniglio anti-53BP1 (1:500) per una notte a 4 °C.
- Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule 3 volte con 30 mL di soluzione bloccante al 2% per ogni 5 minuti su un agitatore da laboratorio.
- Rimuovere la soluzione bloccante e incubare la prima preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato con Alexa488 (1:500) e la seconda preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato con Alexa488 (1:500) e un anticorpo secondario anti-coniglio d'asino coniugato con Alexa555 (1:500) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Terreno di montaggio: Mettere il vetrino con le cellule in una ciotola e lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 ml di PBS per ogni 5 minuti su un agitatore da laboratorio. Rimuovere il PBS e montare le celle con un mezzo di montaggio contenente 4,6-diamidino-2-fenilidolo. Mettere con cautela un vetrino coprioggetti sopra il supporto di montaggio in modo che non siano incorporate bolle d'aria. Attendere almeno 3 ore per l'indurimento del mezzo di montaggio prima di analizzare le celle mediante microscopia a fluorescenza.
3. Analisi dei focolai γH2AX e 53BP1
- Microscopia a fluorescenza: analizza i focolai γH2AX e 53BP1 nei nuclei cellulari con un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante l'imaging con un ingrandimento dell'obiettivo 100X. Registra le immagini con una fotocamera ed elabora le immagini con un software di imaging appropriato.
