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1. Produzione di 15N, 13C-Tau (Figura 1)
- ATransform pET15b-Tau ricombinante T7 espressione plasmide in BL21(DE3) cellule batteriche di Escherichia coli competenti.
NOTA: il cDNA che codifica per l'isoforma Tau più lunga (441 residui di amminoacidi) è clonato tra i siti di restrizione NcoI e XhoI nel plasmide pET15b.
- Mescolare delicatamente 50 μl di cellule BL21(DE3) competenti, formando 1-5 x 107 colonie per μg di DNA plasmidico, con 100 ng di DNA plasmidico in una provetta di plastica da 1,5 ml.
nota: I ceppi batterici ottimizzati per l'uso del codone per l'espressione del cDNA eucariotico non sono essenziali per produrre Tau umana.
- Mettere la miscela di celle sul ghiaccio per 30 minuti e poi scaldare per 10 secondi a 42 °C. Riposizionare la provetta sul ghiaccio per 5 minuti e aggiungere 1 ml di terreno LB (Luria-Bertani) a temperatura ambiente. Incubare la sospensione batterica a 37 °C per 30 minuti agitando delicatamente.
- Distribuire uniformemente con un'ansa di inoculazione 100 μl di sospensione cellulare su una piastra di agar di terreno LB contenente 100 μg/ml di antibiotico ampicillina.
- Incubare la piastra di selezione per 15 ore a 37 °C.
- Mantenere la piastra di selezione a 4 °C fino alla fase di coltura, per un massimo di 2 settimane circa.
NOTA: è possibile preparare una riserva di glicerolo di coltura batterica (50% di glicerolo), conservata a -80 °C, per iniziare la coltura in una fase successiva.
- Aggiungere 1 ml di 1 M di MgSO4, 1 ml di 100 mM di CaCl2, 10 ml di complemento vitaminico 100x MEM, 1 ml di 100 mg/ml di ampicillina a 1 L di sali M9 autoclavati (6 g di Na2HPO4, 3 g di KH2PO4, 0,5 g di NaCl).
nota: Dopo l'aggiunta della soluzione di CaCl2 ai sali M9, si formerà un precipitato bianco che si dissipa rapidamente.
- Solubilizzare 300 mg di terreno completo 15N, 13C, 1 g di 15NH4Cl e 2 g di 13C6-glucosio in 10 ml di terreno M9. Sterilizzare con filtro la soluzione isotopica utilizzando un filtro da 0,2 μm, direttamente nel mezzo M9.
- Sospendere, utilizzando un circuito di inoculazione, una colonia di batteri trasformati pET15b-Tau dalla piastra di selezione in 20 ml di terreno LB integrato con 100 μg/ml di ampicillina.
- Incubare il terreno inoculato a 37 °C per circa 6 ore.
- Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) su 1 ml di una diluizione di dieci volte della coltura batterica in una cuvetta spettrometrica in plastica.
nota: La torbidità della coltura batterica corrispondente a OD600 di 3,0-4,0 indica che la fase di crescita della saturazione è stata raggiunta.
- Aggiungere 20 ml di coltura LB satura a 1 L di terreno di crescita M9 integrato con ampicillina (concentrazione finale di 100 μg/ml), in un pallone di coltura con deflettore di plastica Erlenmeyer da 2 L.
- Collocare il pallone di coltura in un incubatore programmabile impostato a 10 °C e 50 giri/min. Programmare l'incubatrice in modo che passi a 200 giri/min e 37 °C la mattina presto del giorno successivo.
- Misurare OD600 su 1 ml di coltura batterica in una cuvetta spettrometrica di plastica. Aggiungere 400 μl di soluzione madre 1 M IPTG (isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside) (mantenuta a -20 °C) quando OD600 raggiunge un valore di circa 1,0 per indurre l'espressione della proteina Tau ricombinante.
- Continuare l'incubazione a 37 °C per altre 3 ore. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 5.000 x g per 20 minuti.
- Congelare il pellet batterico a -20 °C. Conservare congelato fino alla fase di purificazione, se necessario per un periodo prolungato.
2. Purificazione di 15N, 13C-Tau (Figura 2)
- Tamponi di purificazione a scambio cationico in autoclave (CEX) a 121 °C sotto 15 psi per 20 minuti. Conservare i tamponi a 4 °C.
- Scongelare il pellet di cellule batteriche e risospendere accuratamente in 45 ml di tampone CEX A di estrazione (50 mM di tampone NaPi pH 6,5, 1 mM EDTA) appena integrato con il cocktail di inibitori della proteasi 1x (1 compressa) e DNAseI (2.000 unità).
- Disgregare le cellule batteriche utilizzando un omogeneizzatore ad alta pressione a 20.000 psi. Sono necessari 3-4 passaggi. Centrifugare a 20.000 x g per 40 minuti per rimuovere il materiale insolubile.
- Riscaldare l'estratto di cellule batteriche per 15 minuti a 75 °C con un bagnomaria.
NOTA: dopo pochi minuti si osserva un precipitato bianco.
- Centrifugare a 15.000 x g per 20 minuti e mantenere il surnatante contenente la proteina Tau termostabile.
- Conservare a -20 °C fino alla successiva fase di purificazione, se necessario.
- Eseguire la cromatografia a scambio cationico su una resina CEX forte confezionata come colonna a letto da 5 ml utilizzando un sistema di cromatografia rapida di proteine liquide (FPLC) (Figura 3 A).
- Impostare la portata su 2,5 ml/min.
- Equilibrare la colonna nel buffer CEX A
- Caricare i 60-70 ml di estratto riscaldato contenente Tau utilizzando una pompa per campioni, o in alternativa la pompa A, a seconda del sistema. Raccogliere il flusso per l'analisi per verificare che la proteina Tau si leghi in modo efficiente alla resina (vedere 2.8).
- Lavare la resina con tampone CEX A fino a quando l'assorbanza a 280 nm non torna al valore basale.
- Eluire la Tau dalla colonna utilizzando un gradiente di NaCl a tre stadi ottenuto da un aumento graduale del tampone CEX B (tampone CEX A con 1 M di NaCl). Programmare l'FPLC come segue: il primo passaggio del gradiente al 25% del buffer CEX B in 10 volumi di colonna (CV) per raggiungere 250 mM di NaCl, il secondo passaggio al 50% del tampone CEX B in 5 CV per raggiungere 500 mM di NaCl e il terzo passaggio al 100% del buffer CEX B in 2 CV per raggiungere 1 M di NaCl. Raccogliere 1,5 ml di frazioni durante le fasi di eluizione.
- Analizzare 10 μl delle frazioni raccolte durante la fase di eluizione mediante SDS-PAGE (12% di gel SDS-acrilammide) e colorazione Coomassie (Figura 3 A). Controllare anche la fase di carico sulla colonna analizzando 10 μl del flusso.
- Scegli le frazioni contenenti Tau e raggruppa queste frazioni per il passaggio successivo.
- Eseguire uno scambio di buffer su frazioni aggregate contenenti Tau (Figura 3 B).
- Equilibrare una colonna di desalinizzazione di 53 ml di letto di resina G25 (26 x 10 cm) in 50 mM di bicarbonato di ammonio (tampone volatile) utilizzando un sistema FPLC.
- Impostare la portata su 5 ml/min. Iniettare il campione di Tau sulla colonna tramite un circuito di iniezione da 5 ml. Raccogliere le frazioni corrispondenti al picco di assorbimento a 280 nm.
- Ripetere l'iniezione 3-4 volte, a seconda del volume del pool CEX iniziale.
- Calcolare la quantità di proteina Tau purificata utilizzando l'area del picco del cromatogramma a 280 nm (1 mg di Tau corrisponde a 140 mAU*ml).
nota: Il coefficiente di estinzione della proteina Tau a 280 nm è 7.550 M-1 cm-1. Tau non contiene residui di Trp.
- Raggruppa tutte le frazioni Tau.
- Aliquotare il campione in provette contenenti l'equivalente da 1 a 5 mg di Tau. Scegliere queste provette in modo che il volume della soluzione sia piccolo rispetto al volume della provetta (ad esempio 5 ml di soluzione in una provetta da 50 ml).
- Praticare dei fori nei tappi delle provette utilizzando un ago. Congelare i campioni di Tau a -80 °C.
- Liofilizzare i campioni di Tau. La proteina Tau liofilizzata può essere mantenuta a -20 °C per lunghi periodi di tempo.
3. Fosforilazione in vitro di 15N-tau
- Sciogliere 5 mg di Tau liofilizzata in 500 μl di tampone di fosforilazione (50 mM Hepes·KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
- Aggiungere 2,5 mM di ATP (25 μl di soluzione madre 100 mM mantenuta a -20 °C), 1 mM DTT (1 μl di soluzione madre 1 M mantenuta a -20 °C), 1 mM di EGTA (2 μl di una soluzione madre 0,5 M), 1 cocktail di inibitori della proteasi (25 μl di una soluzione madre 40x ottenuta sciogliendo 1 compressa in 1 ml di tampone di fosforilazione) e 1 μM di His-ERK2 attivato (250 μl in tampone di conservazione 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl e 10% glicerolo, conservato a -80 °C) in un volume totale di campione di 1 ml.
nota: L'His-ERK2 attivato può essere preparato internamente mediante fosforilazione con la chinasi MEK.
- Incubare 3 ore a 37 °C.
- Riscaldare il campione a 75 °C per 15 minuti per inattivare la chinasi ERK.
- Centrifugare a 20.000 x g per 15 min. Raccogliere e conservare il surnatante.
- Dissalare il campione proteico in 50 mM di bicarbonato di ammonio utilizzando una colonna di 3,45 ml di letto di resina G25 (1,3 x 2,6 cm), adatta per un campione da 1 ml.
- Eseguire una SDS-PAGE al 12% con 2,5 μl del campione proteico per verificarne l'integrità e l'efficienza della fosforilazione (Figura 4).
- Liofilizzare il campione di Tau fosforilato. Conservare la polvere a -20 °C.
4. Acquisizione di spettri NMR (Figura 5)
- Solubilizzare 4 mg di 15N, 13C ERK-fosforilato-Tau liofilizzato in 400 μl di tampone NMR (50 mM di NaPi o 50 mM di Tris-d11 deuterato. Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA e 1 mM DTT).
- Aggiungere il 5% di D2O per il blocco sul campo dello spettrometro NMR e 1 mM di TMSP (3-(trimetilsilil)propionico-2,2,3,3-d4 sale sodico acido)) come riferimento del segnale NMR interno. Aggiungere 10 μl di una soluzione madre 40x di un cocktail completo di inibitori della proteasi.
- Trasferire il campione in una provetta NMR da 5 mm utilizzando una siringa elettronica con ago lungo o una pipetta Pasteur. Chiudere il tubo NMR utilizzando lo stantuffo. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra lo stantuffo e il liquido mediante movimenti dello stantuffo.
- Posizionare il tubo NMR in uno spinner. Regolare la sua posizione verticale nella rotella con il manometro appropriato per la testa della sonda NMR utilizzata, in modo tale che la maggior parte della soluzione del campione si trovi all'interno della bobina NMR.
- Avvia il flusso d'aria: fai clic su Solleva nella finestra del sistema di controllo del magnete. Posizionare con cautela l'ogiva con il tubo nel flusso d'aria nella parte superiore del foro del magnete. Arrestare il flusso d'aria (fare clic per sollevare) e lasciare che il tubo scenda in posizione all'interno della testa della sonda nel magnete.
- Impostare la temperatura a 25 °C (298 K).
- Eseguire la sintonizzazione e l'abbinamento semiautomatici della testa della sonda per ottimizzare la trasmissione di potenza. Digita atmm nella riga di comando.
- Bloccare la frequenza dello spettrometro utilizzando il segnale D2O del campione registrato sul canale del deuterio. Fare clic sul lucchetto nella finestra del sistema di controllo del magnete.
- Avviare la procedura di spessoramento per ottimizzare l'omogeneità del campo magnetico nella posizione del campione. Digita topshim gui sulla riga di comando per aprire la finestra dello shim. Fare clic su Avvia nella finestra dello shim. Controllare il valore di variazione standard B0 residuo per verificare che gli spessori siano ottimali (meno di 2 Hz è buono).
- Calibrare il parametro p1 (lunghezza di un impulso a radiofrequenza protonica in μsec), necessario per ottenere una rotazione di 90° degli spin del protone. Puntare all'impulso a 360° utilizzando uno spettro 1D di protoni d'acqua (Figura 6).
- Regolare l'offset di frequenza impostando il parametro o1 (in Hz) sulla frequenza dell'acqua protonica nello spettro 1D (Figura 6).
- Avviare l'acquisizione di uno spettro protonico 1D (sequenza di impulsi con sequenza watergate per la soppressione del segnale dell'acqua, ad esempio, zggpw5) per verificare i segnali provenienti dal campione (Figura 7). Adattare il numero di scansioni alla concentrazione relativa di proteine. Digitare zg nella riga di comando per avviare l'acquisizione.
