1. Concentrazione di lavoro dei componenti di reazione
- Preparare le concentrazioni di lavoro dei tamponi per CD freschi e mantenerle a 4 °C prima di impostare le reazioni.
nota: Per le reazioni CD descritte in questo articolo, le concentrazioni di lavoro dei componenti sono le seguenti: tampone fosfato di sodio (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, proteina 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. Scelta e preparazione delle cuvette CD
- Raccogli gli spettri CD in cuvette di quarzo ad alta trasparenza. Utilizzare cuvette rettangolari o cilindriche.
nota: Per tutte le reazioni descritte in questo articolo è stata utilizzata una cuvetta di quarzo CD (volume nominale di 0,4 mL, lunghezza del percorso di 1 mm).
- Utilizzare una soluzione detergente per cuvette per pulire la cuvetta. Aggiungere l'1% di soluzione detergente per cuvette in acqua per ottenere 400 μl di soluzione, versarla nella cuvetta e incubarla a 37 °C per 1 ora.
- Lavare più volte la cuvetta con acqua per pulire la cuvetta. Eseguire una scansione dell'acqua o del tampone nella cuvetta per verificare se è pulita.
nota: L'acqua o il tampone devono fornire una lettura compresa tra 0 e 1 mdeg.
3. Preparazione di proteine e oligonucleotide di DNA
- Mantenere il volume della proteina al di sotto di 50 μL nella reazione per ridurre al minimo le quantità dei componenti tampone che a volte causano la formazione di picchi ambigui. Mantieni le proteine sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento per evitare qualsiasi degradazione.
- Utilizzare oligonucleotidi di DNA purificati con PAGE nelle reazioni.
nota: Nelle reazioni qui descritte, il DNA è stato utilizzato sia in forma nativa che in forma raffreddata termicamente (raffreddata rapidamente (FC) e raffreddata lentamente (SC)). Il raffreddamento rapido favorisce il legame intramolecolare nel DNA, producendo più strutture secondarie. Al contrario, il raffreddamento lento promuove il legame intermolecolare nel DNA, con conseguente minor numero di strutture secondarie.
- Per un raffreddamento rapido, riscaldare il DNA a 94 °C per 3 minuti sul blocco riscaldante e raffreddarlo immediatamente con ghiaccio. Per un raffreddamento lento, riscaldare il DNA a 94 °C per 3 minuti e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente a una velocità di 1 °C al minuto.
4. Impostazione di esperimenti di controllo per registrare gli spettri di base
- Mantenere il volume di reazione a 300 μl in tutte le reazioni. Impostare un totale di 5 reazioni di base in provette da centrifuga da 1,5 mL, una per una, come segue: i) tampone + acqua; ii) Tampone + MgCl2 + ATP + Acqua; iii) tampone + MgCl2 + ATP + proteine + acqua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampone + Proteine + Acqua.
5. Impostare gli esperimenti per registrare gli spettri dei CD
- Impostare un totale di 5 reazioni, una per una, in provette da centrifuga da 1,5 mL come segue: i) Tampone + DNA + Acqua; ii) tampone + DNA + MgCl2 + ATP + acqua; iii) tampone + DNA + MgCl2 + ATP + proteina + acqua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampone + DNA + Proteine + Acqua.
6. Scansione della registrazione
- Accendi il gas e accendi lo spettrometro CD.
- Accendere la lampada dopo 10-15 minuti. Accendere il bagnomaria e impostare la temperatura del supporto a 37 °C.
- Aprire il software CD Spectrum.
- Impostare la temperatura a 37 °C.
- Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda su 180 - 300 nm.
- Impostare il tempo per punto su 0,5 s.
- Impostare il numero di scansione su 5.
- Fai clic su Pro-Data Viewer, crea un nuovo file e rinominalo con i dettagli sull'esperimento e la data.
- Mantenere tutti i componenti di reazione sul ghiaccio per evitare qualsiasi degrado. Realizzare le linee di base e le reazioni, una per una, nelle provette da centrifuga e mescolarle mediante pipettaggio. Trasferire con cura la miscela di reazione nella cuvetta, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.
- Se si esegue un esperimento con andamento temporale, incubare le reazioni a 37 °C per il tempo richiesto ed eseguire la scansione. Aggiungere EDTA al tampone contenente DNA, ATP, Mg+2 e proteine per arrestare l'idrolisi dell'ATP.
- Aumentare la concentrazione di EDTA e il suo tempo di incubazione per inibire completamente l'attività dell'ATPasi.
- Sottrarre le linee di base dalle reazioni corrispondenti nel software (ad esempio, sottrarre la reazione 1 dalla linea di base 1). Smussare i dati nel software dello spettro CD o nel software di tracciatura dei dati. Traccia i dati nel software di tracciatura dei dati.
nota: Sottraendo le linee di base dalle reazioni corrispondenti si otterrà lo spettro netto CD del solo DNA.
7. Analisi e interpretazione dei dati
- Utilizzare la formula data dall'eq (1) per convertire i valori ottenuti in milligradi nell'ellitticità media dei residui.
Qui, S è il segnale CD in milligradi, c è la concentrazione di DNA in mg/mL, mRw è la massa media del residuo e l è la lunghezza del percorso in cm.
- Traccia un grafico rispetto alla lunghezza d'onda e all'ellitticità media dei residui utilizzando il software di tracciamento dei dati e analizza i picchi.
- Per tracciare il grafico, selezionare l'ellitticità media dei residui sull'asse Y e la lunghezza d'onda sull'asse X e tracciare un grafico a linee rette.
nota: Questo grafico fornirà i picchi caratteristici di diverse forme di DNA. Le forme di DNA corrispondenti ai picchi possono essere identificate utilizzando la letteratura esistente.