Un test immunologico diretto basato sulla spettroscopia Raman per rilevare un antigene specifico

Abstract

Fonte: Hanson, C., et al. Fabbricazione di una piattaforma di immunodosaggio per spettroscopia UV-Vis e Raman. (2016).

In questo video, descriviamo il metodo di immunodosaggio diretto basato sulla spettroscopia Raman per rilevare specifici antigeni bersaglio. Gli anticorpi, che vengono adsorbiti sulla superficie delle nanoparticelle d'oro attaccate alle sonde Raman, interagiscono con gli antigeni bersaglio e producono uno spettro Raman specifico, che viene successivamente rilevato.

Protocollo

1. Prepara le sonde UV-Vis/Raman

1. Preparare una soluzione AuNP nuda
   1. Preparare una soluzione di 2 ml di AuNP con una concentrazione di circa 1 x 1011 particelle per ml.
      1. Se le AuNP devono essere concentrate, riempire le provette da centrifuga a basso legame con 2.000 μl di AuNP madre e centrifugare a 5.000 x g per 20 minuti o fino a quando il surnatante non è limpido. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio, facendo attenzione a non disturbare il pellet AuNP.
      2. Combinare le restanti soluzioni di AuNP in un'unica provetta e stimare la concentrazione ottenendo una misurazione UV-Vis e confrontando i valori con le concentrazioni note, poiché si tratta di una relazione lineare.
2. Determinare il rapporto di etichettatura del reporter Raman appropriato
   1. Preparare una soluzione funzionante del reporter Raman disciolto in metanolo. Questa concentrazione dipenderà dal reporter utilizzato. In questo lavoro, preparare lo ioduro di 3,3′-dietiltiatricarbocianina (DTTC) con una soluzione di lavoro di 200 μM.
   2. Supponendo un volume finale di 100 μl per ciascun pozzetto, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione reporter di lavoro a ciascun pozzetto della prima fila di una piastra da 96 pozzetti in modo che il reporter Raman abbia concentrazioni comprese tra 0,2 μM e 10 μM. Aggiungere una quantità sufficiente di acqua HPLC in ciascun pozzetto in modo che il volume sia di 80 μl. Aggiungere 20 μl di AuNP a ciascun pozzetto per ottenere un volume finale di 100 μl per ciascun pozzetto. Un esempio è fornito nella Tabella 1.
   3. Misura gli spettri UV-Vis da 400 a 700 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a lettura di piastra. La concentrazione appropriata è la concentrazione più alta con picchi definiti per gli spettri UV-Vis. Ripetere il passaggio 2.2.2 a concentrazioni crescenti fino a trovare il rapporto di concentrazione più elevato tra reporter Raman e AuNPs.
      nota: Il colorante e la forma, le dimensioni e il produttore dell'AuNP influenzano la concentrazione appropriata. Pertanto, i passaggi elencati devono essere valutati e modificati a seconda dei componenti utilizzati. Questo protocollo prevedeva l'uso di un colorante caricato positivamente. Pertanto, il legame tra l'AuNP e il reporter è stato migliorato utilizzando AuNP caricati negativamente. Ciò è stato fatto utilizzando AuNP con tappo di citrato. Per ulteriori dettagli, vedere la sezione Discussione.
3. Collegamento del reporter Raman e del PEG-Ab all'AuNP
   1. Preparare due lotti da 1,5 ml di AuNP e Raman reporter alla concentrazione precedentemente determinata, lasciando che il Raman reporter si leghi alle AuNP per 30 minuti a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere l'anticorpo PEGilato (PEG-Ab) a un lotto della soluzione reporter AuNP e Raman per creare un rapporto di 200:1 tra anticorpi e particelle. Questa soluzione sarà per i campioni di prova. In una provetta da microcentrifuga separata, aggiungere l'antigene PEGilato all'altro lotto della soluzione reporter AuNP e Raman con un rapporto di 200:1 tra anticorpi e particelle da utilizzare come controllo. Incubare le soluzioni per 30 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Il rapporto tra anticorpi e particelle sarà specifico per le AuNP e il colorante utilizzato e dovrebbe essere ottimizzato per ogni singolo caso. L'obiettivo qui è quello di avere il più alto rapporto di anticorpi a cui le sonde AuNP possono legarsi, prevenendo l'aggregazione delle particelle. Utilizzare la seguente equazione per determinare i volumi appropriati da sommare:
      
      dove V è il volume e C è la concentrazione espressa in particelle o anticorpi per ml. Il volume finale dovrebbe essere di circa 1,5 ml.
4. Bloccare i siti rimanenti sulla superficie AuNP con mPEG-SH.
   1. Preparare mPEG-SH sciogliendo il metossi polietilenglicole tiolo solido a una concentrazione di 200 μM utilizzando acqua. Agitare la soluzione fino a quando mPEG-SH non è completamente disciolto.
   2. Aggiungere mPEG-SH con un rapporto di 40.000:1 alla soluzione AuNP-PEG-Ab realizzata al passaggio 2.3. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 minuti per assicurarsi che i siti rimanenti sulla nanoparticella d'oro siano bloccati. Utilizzare la seguente equazione per determinare i volumi appropriati da sommare:
      
      dove V è il volume e C è la concentrazione espressa in particelle o anticorpi per ml. Il volume finale dovrebbe essere di circa 1,5 ml.
5. Recupera le sonde Raman funzionalizzate.
   1. Centrifugare le particelle a 5.000 x g per 20 minuti in provette da centrifuga a basso legame o fino a quando il surnatante non è limpido. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio, facendo attenzione a non disturbare le AuNP.
   2. Risospendere le particelle con 1 ml di soluzione 1x PBS prodotta in precedenza. Stimare la concentrazione di AuNP effettuando una misurazione UV-Vis di un piccolo volume di soluzione (3 μl) e confrontare i risultati con le misurazioni di una concentrazione nota di AuNP. Regolare il volume in modo che la soluzione finale sia almeno 1 x 10¹¹ particelle per ml.
   3. Conservare le soluzioni a 4 °C fino a quando non vengono utilizzate per funzionalizzare la piastra di immunodosaggio. Usa le soluzioni entro una settimana.

Tabella 1. Esempio di diluizione DTTC. Varie diluizioni di DTTC e i volumi associati di DTTC di riserva, soluzione di nanoparticelle d'oro e acqua.

	Volumi da aggiungere di ogni componente (ml)
Concentrazione finale DTTC (mM)	Soluzione di lavoro DTTC (200 mM)	AuNP	Acqua
0,2	0,1	20	79,9
0,6	0,3	20	79,7
1	0,5	20	79,5
numero arabo	1.0	20	79
5	2.5	20	77,5
7	3.5	20	76,5
10	5.0	20	75

2. Preparazione della piastra per immunodosaggio

1. Legare l'antigene desiderato alla piastra di immunodosaggio.
   1. Preparare una quantità sufficiente di antigeni diluiti (50 μg/ml) per riempire i pozzetti del polistirene. Agitare la soluzione e aggiungere immediatamente la soluzione ai pozzetti della piastra. Lasciare che l'antigene si leghi alle piastre per 1 ora a temperatura ambiente.
2. Lavare via gli antigeni non legati.
   1. Rimuovere la soluzione antigenica in eccesso versandola in un contenitore per lo smaltimento e colpendo la piastra contro un piano del tavolo coperto di carta assorbente.
   2. Aggiungere TBST ai pozzetti per lavare la superficie, quindi rimuovere il lavaggio nello stesso modo indicato in precedenza. Ripeti questo passaggio altre due volte.
3. Bloccare i siti di legame rimanenti sulla piastra per evitare legature non specifiche.
   1. Aggiungere 70 μl di soluzione bloccante HSA in ciascun pozzetto della piastra e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
   2. Rimuovere e risciacquare la piastra utilizzando la stessa procedura specificata al punto 3.2. Coprire la piastra e conservare all'asciutto a 4 °C fino al momento dell'uso.
4. Funzionalizzare la piastra per immunodosaggio.
   1. Aggiungere 70 μl delle nanoparticelle della sonda preparate nella Sezione 2 alla prima colonna di una piastra a 96 pozzetti e diluire le colonne successive utilizzando una diluizione seriale 1:2. Lasciare incubare la piastra per almeno 1 ora. Un esempio di come preparare la piastra per immunodosaggio è riportato nella Figura 1.
   2. Lavare la piastra con TBST cinque volte come descritto al punto 3.2, assicurandosi di smaltire le AuNP in modo appropriato. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 70 μl di 1x PBS a ciascun pozzetto e coprire con un sigillo per piastre.
      NOTA: I campioni di controllo devono essere chiari. Se si è verificato il legame non specifico, i campioni di controllo avranno un colore simile a quello dei campioni di test.
5. Testare la sensibilità del saggio mediante spettroscopia UV-Vis e Raman.
   1. Per ogni pozzetto, misurare gli spettri UV-Vis compresi tra 400 e 700 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a lettura di piastra.
   2. Utilizzando un microscopio Raman invertito, focalizzare l'obiettivo sulla superficie del pozzo che ha le sonde AuNP. Ottieni gli spettri Raman del pozzo. Raccogli uno spettro che va da 1.800 ^cm-1 a 400 ^cm-1. Ripeti questo passaggio per tutti i pozzetti.
   3. Utilizzando un software spettrale appropriato, eseguire una correzione della linea di base polinomiale di 11^° ordine per gli spettri Raman e un polinomio di 3^° ordine per gli spettri UV-Vis.
   4. Utilizzando un software spettrale appropriato, normalizzare gli spettri Raman e UV-Vis. Impostare il valore massimo su 1 e scalare tutti gli altri valori di conseguenza. Per normalizzare gli spettri Raman, selezionare un picco di polistirene univoco e impostarlo su 1, quindi ridimensionare tutti gli altri valori di conseguenza.
   5. Utilizzando un software spettrale appropriato, eseguire l'integrazione dei picchi per ogni spettro. Per gli spettri Raman, il picco che rappresenta il reporter Raman deve trovarsi in una regione priva di picchi di polistirene. Per eseguire l'integrazione dei picchi, specificare i limiti integrali per il picco desiderato e registrare l'area del picco desiderata per tutti i campioni, inclusi i controlli.
   6. Tracciare l'area media del picco di interesse in funzione del log della concentrazione di AuNP con barre di errore per ogni punto che indicano la deviazione standard associata. Adatta questi punti di calibrazione a una curva logistica a 4 parametri.
   7. Determinare il valore medio del bianco calcolando la media dell'area del picco di interesse per un campione bianco. Determinare la deviazione standard di queste aree; Questa è la deviazione standard del grezzo.
   8. Per lo stesso picco analizzato nel passaggio precedente, trovare la deviazione standard di quell'area del picco per la concentrazione più bassa.
   9. Calcolare il limite del bianco e il limite inferiore di rilevamento come specificato nella sezione Risultati rappresentativi. Utilizzare questi valori con le curve di calibrazione 4PL per determinare il LLOD in termini di concentrazione di AuNP.

Risultati

Figura 1. Piastra per immunodosaggio preparata. Immagine di una piastra di dosaggio immunologico preparata. Le righe da A a E sono campioni di prova, mentre le righe da F a H sono campioni di controllo. La colonna 1 contiene le nanoparticelle non diluite e ogni colonna successiva ha la metà della concentrazione delle sonde AuNP.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nanoparticella d'oro da 60 nm	Ted Pella, Inc.	Codice: 15708-6	Si tratta di nanoparticelle d'oro ricoperte di citrato. Si veda la discussione sulla relazione tra il reporter Raman e la carica di superficie AuNP e la sua importanza per la corretta selezione di AuNP e/o reporter Raman.
bicarbonato di sodio	Fisher Scientifico	S233-500
metanolo	Pharmco-Aaper	Codice 339000000
Soluzione salina tamponata Tris (10x) pH 7,5	Scy Tek	TBD999
Unità di filtrazione per bottiglie	VWR	Codice 97066-202
Tween 20 (polisorbato 20)	Scy Tek	TWN500	Utilizzato come emulsionante per le fasi di lavaggio.
Soluzione salina tamponata con fosfato 10x concentrato, pH 7,4	Scy Tek	PBD999
Proteina LoBind Tubo 2,0 ml	Provette Eppendorf	22431102	Le provette LoBind impediscono il legame di proteine e AuNP alle superfici delle provette.
Proteina LoBind Tubo 0,5 ml	Provette Eppendorf	22431064	Le provette LoBind impediscono il legame di proteine e AuNP alle superfici delle provette.
Dispositivi per micropiastre UniSeal	GE Sanità	7704-0001	Utilizzato per la sigillatura e lo stoccaggio di lastre funzionalizzate.
Piastra di saggio, con coperchio a bassa evaporazione, fondo piatto a 96 pozzetti	Costar	3370
Acqua di grado HPLC	Sigma Aldrich	Codice 270733-4L
ioduro di 3,3′-dietiltiatricarbocianina (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Reporter Raman
mPEG-Tiolo, MW 5.000 - 1 grammo	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1 grammo	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA ha un fine NHS.
IgG di topo, controllo dell'intera molecola	Thermo Fisher Scientifico	Codice: 31903	antigene
Anticorpo secondario adsorbito incrociato IgG (H+L) di capra	Thermo Fisher Scientifico	Telefono 31164	anticorpo
Soluzione bloccante dell'albumina sierica umana	Sigma Aldrich	A1887-1G	In alternativa può essere utilizzata l'albumina sierica bovina.
Spettrofotometro UV-Vis	Termo Scientifico	Nanogoccia 2000c
Spettrofotometro UV-Vis	BioTek	Sinergia 2
Unità di microscopio Raman invertito da 785 nm costruita internamente	N/A	N/A	Un microscopio Raman invertito è il migliore per una corretta messa a fuoco sulla superficie della piastra a pozzetti. In caso contrario, verrà utilizzato un ingrandimento molto basso a causa dell'altezza della piastra a 96 pozzetti. È stato utilizzato un sistema costruito internamente in quanto era più economico rispetto all'acquisto da un fornitore. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi sistema di microscopio Raman invertito disponibile in commercio.