Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Iniezione intra-cisternale di topi
NOTA: L'intera procedura viene eseguita nella cabina a flusso laminare per mantenere le condizioni asettiche.
- Ospita topi da laboratorio (femmina Balb/c di 8 settimane) in specifiche condizioni prive di agenti patogeni. Fornire pellet alimentari e acqua ad libitum.
- Sistemare gli animali nel nuovo ambiente per 1 settimana prima di iniziare l'esperimento.
- Prima di iniziare l'esperimento, pesare e valutare la loro temperatura corporea.
nota: I topi femmina consanguinei Balb/c di otto settimane pesano in media circa 19 g. La temperatura media dei topi da laboratorio varia fisiologicamente da 36 a 38 °C.
- Togliere l'animale dal collo, pulire l'area dell'addome con etanolo al 70% e iniettare destrano di ferro i.p. (disciolto in tampone salino fosfato all'1%, 250 mg/kg) nel quadrante inferiore destro dell'addome murino utilizzando un ago da 25 G 0,5 mm x 16 mm, circa 2-3 ore prima dell'infezione><.
nota: L'iniezione intraperitoneale è stata eseguita nel quadrante inferiore destro dell'addome murino per evitare di danneggiare gli organi addominali come la vescica urinaria, il cieco, ecc. La somministrazione di una fonte di ferro esogeno, sotto forma di ferro destrano, agli animali prima dell'infezione favorisce la moltiplicazione batterica nell'ospite.
- Dopo 2-3 ore, eseguire l'anestesia animale con ketamina (50 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg) e lubrificante oftalmico.
- Verificare la profondità dell'anestesia assicurandosi dell'assenza di risposta al dolore quando si pizzica l'alluce.
- Posizionare il mouse in decubito sternale e allungare con cura gli arti e il rachide cervicale per mantenere la colonna vertebrale in posizione diritta.
- Mescolare delicatamente la sospensione batterica per mantenere una sospensione costante prima di caricare una siringa da 30 G di ago x 8 mm.
nota: Preparare la sospensione batterica il più vicino possibile al momento dell'iniezione; Nel frattempo, conservatelo a temperatura ambiente.
- Sulla base del titolo batterico post-scongelamento (CFU/mL), procedere con il calcolo delle CFU totali da utilizzare, rispetto al numero totale di animali da infettare (CFU dose batterica per numero di animali). Procedere con il calcolo del volume esatto da prelevare dal flaconcino per ottenere le CFU totali applicando una proporzione tra il titolo batterico post-scongelamento (CFU/mL) e le CFU totali utili per l'infezione di n topi (titolo batterico post-scongelamento CFU: ml = CFU totali: x). Stabilire il volume finale rispetto al numero totale di animali da infettare.
nota: In questi esperimenti è stata utilizzata un'ampia gamma di titoli da 104 a 109 per animale.
- Pulire l'area chirurgica con etanolo al 70%.
- Identificare il punto di iniezione con l'aiuto di un ago e iniettare la CFU stabilita di meningococchi (ceppo wild-type e ceppo mutante isogenico), o brodo GC integrato con destrano di ferro (5 mg/kg) come controllo, in un volume totale di 10 μL nella cisterna magna dei topi attraverso un foro di fresa occipitale utilizzando un ago da 30 G x 8 mm.
- Eseguire l'inoculo cisternale posizionando l'ago in corrispondenza della giunzione craniocervicale, in particolare nello spazio subaracnoideo dorsale. Ventroflex la testa per rendere accessibile questo spazio.
- Brevemente, posizionare l'animale in decubito laterale, tenere le orecchie fuori mano e flettere moderatamente il collo (da 90 a 100°). Assicurarsi che la linea mediana del collo e la testa (dal naso all'occipite) siano in una posizione perfettamente parallela al piano del tavolo.
- Toccare le ali dell'atlante e assicurarsi che si sovrappongano, eliminando la rotazione assiale. Una rientranza naturale di solito può essere toccata sulla linea mediana dove è più probabile che l'ago entri nel foro occipitale.
- Gettare la siringa e l'ago in modo sicuro dopo l'iniezione di Neisseria nei topi.
- Posizionare l'animale nella gabbia e attendere il risveglio e il pieno recupero del movimento.
- Tenere le gabbie con i topi infetti sotto una cappa a flusso laminare.
- Monitorare i topi, 24 ore dopo l'infezione, per segni clinici di coma secondo la scala del coma. Scala del coma: 1 = coma, 2 = non si alza in piedi dopo essere stato girato sulla schiena, 3 = sta in piedi entro 30 s, 4 = sta in piedi entro 5 s, attività ambulatoriali minime, 5 = normale.
nota: Quando negli animali è stato registrato dolore, è stata somministrata analgesia con meloxicam (5 mg/kg i.p. per la durata dello studio).
2. Sopravvivenza degli animali e conteggi dei CFU
- Sopravvivenza animale
- Preparare inoculi batterici a dosi diverse (da 104 a 109 CFU per topo) per infettare gli animali per via i.cista.
- Inoculare i topi di controllo con brodo GC, integrato con destrano di ferro (5 mg/kg), allo stesso modo.
- Monitorare gli animali per i sintomi clinici: pelo arruffato, aspetto curvo, ipotermia, perdita di peso, letargia o moribondo ogni giorno durante l'intero esperimento per 168 ore (7 giorni) almeno due volte al giorno per tutta la durata dell'esperimento.
- Misurare il peso corporeo e la temperatura utilizzando una bilancia digitale e un termometro rettale, rispettivamente, ogni giorno.
- Registra la sopravvivenza dei topi per una settimana.
nota: Registrare la morte naturale dell'animale post infezione mentre gli animali che raggiungono un valore di coma di 2 o che sopravvivono oltre 168 ore di osservazione saranno soppressi.
- Anestetizzare i topi con un valore di coma di 2 o che sopravvivono oltre il tempo di osservazione con ketamina (50 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg) e applicare un unguento oftalmico.
- Verificare che la risposta al dolore sia assente da un pizzico di dito del piede.
- Eseguire l'eutanasia di topi per lussazione cervicale e registrarli come morti per l'analisi statistica.
- Procedere per il test di sopravvivenza animale o conteggio CFU sugli animali infetti.