Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Sorgente del mouse e alloggiamento
- Derivare topi LysM-eGFP su un background genetico C57BL/6J. Derivare topi LysM-EGFP×MyD88-/- incrociando topi LysM-EGFP con topi MyD88-/- su uno sfondo C57BL/6J.
- Domestico i topi in un vivaio. Per questi studi, gli animali sono stati alloggiati presso l'Università della California, Davis in gruppi prima dell'intervento chirurgico e alloggiati singolarmente dopo l'intervento chirurgico. Usa topi di età compresa tra 10 e 16 settimane.
2. Preparazione e quantificazione batterica
- Rimuovere il ceppo bioluminescente di S. aureus di interesse dalla conservazione a -80 °C per scongelarlo su ghiaccio. Striare su una piastra di agar di sangue bovino al 5%. Incubare la piastra striata in un'incubatrice umidificata a 37 °C per una notte (16 h).
nota: In questo protocollo è stato utilizzato il ceppo ALC2906 SH1000. Questo ceppo contiene il plasmide navetta pSK236 con i promotori della proteina 2 legante la penicillina fusi alla cassetta reporter luxABCDE di Photohabdus luminescens.
- Preparare il brodo di soia triptico (TSB) mescolando 0,03 g di polvere TSB per ml di acqua pura e sterilizzare in autoclave. Una volta raffreddato, aggiungere gli antibiotici necessari utilizzando una tecnica sterile. In questo protocollo, aggiungere 10 μg/mL di cloramfenicolo al TSB per selezionare l'espressione del plasmide navetta pSK236, che contiene la cassetta luxABCDE a bioluminescenza.
- Prelevare 3-4 colonie separate dalla piastra di S. aureus in TSB con 10 μg/mL di cloramfenicolo per iniziare una coltura notturna. Incubare i batteri su un agitatore di incubazione a 37 °C per una notte (16 ore).
- Avviare una nuova coltura batterica dalla coltura notturna diluendo un campione 1:50 in TSB con 10 μg/mL di cloramfenicolo. Coltura in agitatore di incubazione a 200 giri/min e 37 °C.
- Due ore dopo la scissione di S. aureus, monitorare la densità ottica a 600 nm (OD600) su uno spettrofotometro. Osservare l'OD600 rispetto al tempo per trovare la crescita della fase medio-logaritmica. Per il ceppo SH1000 ALC2906, un OD600 di 0,5 è medio-logaritmico e corrisponde a una concentrazione di 1 x 108 CFU/mL (Figura 1).
- QuandoOD 600 è 0,5, lavare i batteri 1:1 con DPBS ghiacciato. Centrifugare i batteri per 10 minuti a 3.000 x g e 4 °C. Decantare accuratamente il surnatante e aggiungere altro DPBS refrigerato e agitare accuratamente. Centrifugare nuovamente per 10 minuti a 3.000 x g e 4 °C.
- Decantare accuratamente il surnatante. Risospendere il pellet batterico alla concentrazione desiderata. Per questi studi, raccogliere 3 mL di ALC2906 SH1000 e risospendere in 1,5 mL di PBS, correlando a una concentrazione batterica di circa 2 x 108 CFU/mL. Tenere i batteri sul ghiaccio fino all'uso.
- Per verificare la concentrazione batterica, diluire 100 μl del campione batterico 1:10.000 e 1:100.000 in PBS. Piastra Aliquote da 20 μl su una piastra di agar. Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato per 16 ore. Contare le CFU mediante esame macroscopico e calcolare una concentrazione batterica il giorno successivo.
3. Ferite cutanee escissionali e inoculazione con S. aureus
- Somministrare 100 μL di 0,03 mg/mL di buprenorfina cloridrato (~0,2 mg/kg) a ciascun topo tramite iniezione intraperitoneale.
- Venti minuti dopo l'iniezione, posizionare 2-4 topi in una camera con 2-3 LPM di ossigeno con il 2-4% di isoflurano. Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, trasferire i topi uno alla volta in un cono nasale collegato a 2-3 LPM di ossigeno con isoflurano al 2-4%. Verificare che i topi siano completamente anestetizzati pizzicando con decisione ciascuna zampa posteriore tra il pollice e l'indice. Procedi al passaggio successivo se l'animale non risponde al pizzico.
- Radi una sezione di 1 pollice per 2 pollici sul retro del mouse con un tagliaunghie elettrico e pulisci l'area dai ritagli di pelo usando una salvietta pulita o una garza. Evita di usare la lozione depilatoria perché potrebbe causare un'infiammazione eccessiva.
- Pulisci prima il dorso del mouse con una garza imbevuta di iodio povidone al 10% e poi con una garza imbevuta di etanolo al 70%. Pulire l'area a spirale, spostandosi verso l'esterno dal centro dell'area chirurgica. Attendere circa 1 minuto affinché l'area chirurgica si asciughi prima dell'intervento.
- Tenere il dorso rasato del mouse senza stringere tra due dita e premere con decisione una biopsia sterile con punch da 6 mm al centro dell'area chirurgica preparata. Non tendere la pelle.
- Ruotare la biopsia del punzone per creare un contorno circolare sulla pelle che tagli completamente la pelle in almeno una sezione del contorno. Fare attenzione a non tagliare la fascia o il tessuto sottostante.
- Utilizzare forbici e pinze sterili per tagliare l'epidermide e il derma seguendo lo schema circolare impresso dalla biopsia del punzone.
4. Inoculazione di S. aureus
- Riempire una siringa da insulina da 28 G con l'inoculante batterico bioluminescente desiderato. In questo studio, somministrare una concentrazione di 1 x 108 CFU/mL (50 μL). Non somministrare più di 100 μL di volume.
- Iniettare 50 μL di inoculante tra la fascia e il tessuto al centro della ferita sul dorso del topo. Assicurarsi che l'inoculante formi una bolla al centro della ferita con perdite o dispersioni minime.
- Tirare il derma di lato, tenere la siringa quasi parallela al tessuto e spingere lentamente la siringa nel tessuto fino a quando non si avverte un'improvvisa diminuzione della resistenza, che indica la perforazione della fascia. Guidare con cautela la siringa al centro della ferita ed erogare lentamente l'inoculante. Rimuovere lentamente la siringa dall'animale.
- Iniettare lo stesso volume di PBS sterile nelle ferite degli animali non infetti come descritto sopra.
- Rimetti l'animale nella sua gabbia. Posiziona la gabbia sotto una lampada riscaldante o sopra un termoforo e monitora l'animale fino al recupero dall'anestesia.
5. In Vivo BLI e FLI
- Inizializzare l'intero imager dell'animale tramite il software dello strumento. Anestetizzare i topi in una camera che riceve 2-3 LPM di ossigeno con il 2-4% di isoflurano. Erogare l'anestesia ai coni portamuso all'interno dell'imager.
- Posizionare il topo ferito e infetto nell'imager. Posizionare il mouse in modo che la ferita sia il più piatta possibile. Utilizzare la seguente sequenza per visualizzare i topi.
- Selezionare Luminescenza e Fotografia come modalità di imaging. Il tempo di esposizione è di 1 minuto con binning piccolo e F/stop 1 (luminescenza) e F/stop 8 (fotografia). Il filtro di emissione è aperto. Fare clic sul pulsante Acquisisci per registrare l'immagine.
- Selezionare Fluorescenza e Fotografia come modalità di imaging. Il tempo di esposizione è di 1 s a piccolo binning e F/stop 1 (fluorescenza) e F/stop 8 (fotografia) con una lunghezza d'onda di eccitazione di 465/30 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 520/20 nm con un'elevata intensità della lampada. Fare clic sul pulsante Acquisisci per registrare l'immagine.
- Rimetti l'animale nella sua gabbia e monitoralo fino al recupero dall'anestesia.
- Immagine dei topi ogni giorno come descritto sopra.
6. Analisi delle immagini
- Immagini aperte da quantificare.
- Posiziona un'ampia regione circolare di interesse (ROI) su tutta l'area della ferita, inclusa la pelle circostante, per ogni mouse nell'immagine. I segnali FLI EGFP in vivo dei neutrofili e i segnali BLI S. aureus in vivo si estendono oltre il bordo della ferita dopo diversi giorni e sono stati inclusi in questi studi (Figure 2A e 2B). Fare clic su Misura ROI e registrare i valori per il flusso medio per ciascun mouse. Traccia il flusso medio di ciascun segnale (p/s) rispetto al tempo.
- Se si desidera un numero assoluto di neutrofili o S. aureus nella ferita, eseguire i seguenti esperimenti.
- Per correlare il numero di neutrofili ai segnali FLI EGFP in vivo, avvolgere i topi C57BL/6J come descritto sopra e trasferire una gamma di neutrofili derivati dal midollo osseo (da 5 x 105 a 1 x 107) da donatori LysM-EGFP o LysM-EGFPxMyD88-/- direttamente sopra diverse ferite. Immagine come descritto sopra e correlare i segnali FLI EGFP in vivo con la quantità nota di neutrofili.
- Per correlare la CFU di S. aureus ai segnali BLI in vivo, ferire e infettare i topi come descritto sopra. Il giorno 1 dopo l'infezione, registra i segnali BLI in vivo dai topi e immediatamente sopprime e raffredda le carcasse. Asportare la ferita, omogeneizzare il tessuto e piastrare le diluizioni batteriche su agar per l'incubazione notturna. Il giorno successivo, contare le colonie per determinare le CFU per ferita.
- Per misurare la guarigione della ferita, inserire una ROI circolare sul bordo della ferita e misurare l'area della ferita (cm2) e tracciare la variazione frazionaria rispetto al basale rispetto al tempo (Figura 2C).
