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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Induzione dell'infiammazione della superficie oculare murina
- Eseguire la preparazione dell'immunogeno per l'immunizzazione.
- Preparare l'immunogeno fresco il giorno dell'immunizzazione, mescolando l'ovoalbumina (OVA, 50 mg/mL) e la tossina della pertosse (100 μg/mL) in soluzione fisiologica e l'adiuvante idrossido di alluminio (40 mg/mL) (vedi Tabella dei materiali) in una proporzione 1:1.
cautela: Eseguire l'apertura, la ricostituzione e la preparazione immunogena della tossina della pertosse in una cabina di sicurezza laminare. Indossare indumenti protettivi ed evitare qualsiasi contatto con la pelle.
- Incubare la miscela di immunogeno e adiuvante a temperatura ambiente per 30 minuti e caricare 100 μl in una siringa da 1 mL.
- Eseguire l'iniezione intraperitoneale della soluzione di immunogeno in un topo non anestetizzato.
- Tieni il mouse delicatamente per la coda mentre afferri la griglia della gabbia. Tenere saldamente la pelle della schiena e la regione del collo tra il pollice e l'indice e fissare la coda e gli arti inferiori tra l'anulare e il mignolo contro il palmo della mano.
- Tieni il mouse fisso con la testa rivolta verso il basso.
- Iniettare 100 μl della soluzione di immunogeno preparata nel quadrante destro o sinistro della cavità addominale inferiore.
- Eseguire il test di provocazione della superficie oculare 2 settimane dopo l'immunizzazione.
- Anestetizzare il topo con isoflurano (2,5%).
- Applicare 5 μL di OVA (50 mg/mL) o soluzione fisiologica (0,9 % NaCl) per occhio su entrambi gli occhi e attendere che la goccia venga assorbita dall'occhio. Questo richiede ~5 min.
- Ripetere la procedura 1 volta al giorno per 7 giorni.
nota: La somministrazione topica di farmaci può essere effettuata allo stesso modo.
2. Raccolta di essudati oculari
- Recuperare gli essudati oculari formatisi durante la fase di provocazione applicando 50 μL di soluzione fisiologica sterile sull'occhio subito dopo la provocazione.
3. Escissione di tessuti superficiali oculari
- Sezionare le palpebre e il globo oculare seguendo i passaggi seguenti.
- Eutanasia del topo per asfissia da CO2 e lussazione cervicale.
- Posiziona il mouse su una superficie piana.
- Disinfettare l'area orbitale intorno all'occhio con un tampone impregnato di etanolo al 70%.
- Praticare un'incisione tra l'orecchio e il seno retro-orbitale e lungo la superficie sopra l'osso squamoso verticalmente, estendendo l'incisione orizzontalmente sotto la palpebra inferiore lungo l'osso mascellare e sopra la palpebra superiore lungo l'osso frontale. Questo forma un'incisione intorno all'occhio (Figura 1).
- Tenere con cura il tessuto sezionato intorno all'occhio usando una pinza curva ed estrarre il tessuto e il bulbo oculare.
- Mettere gli organi asportati in PBS sterile.
- Tagliare il tessuto muscolare facciale in eccesso intorno alle palpebre superiori asportate usando un bisturi e sotto lo stereomicroscopio.
- Raccogli la congiuntiva seguendo i passaggi seguenti.
- Posizionare la palpebra superiore su una capsula di Petri asciutta sotto lo stereomicroscopio.
- Usando una pinzetta sottile e un bisturi, staccare molto delicatamente lo strato bianco-mucoso dalla superficie interna della palpebra.
- Quindi, seziona la cornea seguendo i passaggi seguenti.
- Posizionare il globo oculare su una nuova capsula di Petri asciutta sopra il ghiaccio secco per 3 minuti.
- Portare la capsula di Petri sulla superficie del banco in una posizione stabile.
- Fai una piccola incisione sul bordo della cornea vicino al limbus usando forbici sottili e affilate.
- Prolungare l'incisione con il bisturi attorno al globo oculare, separando la sclera dalla cornea.
- Rimuovere i resti dell'iride e del cristallino dalla parte posteriore della cornea sciacquando generosamente con una soluzione salina.
