Identificazione degli inibitori delle chinasi che modulano la risposta dei timociti a forti segnali TCR

Abstract

Fonte: Chen, E. W., et al. Identificazione di mediatori della segnalazione del recettore delle cellule T tramite lo screening di librerie di inibitori chimici. J. Vis. Exp. (2019).

In questo video, descriviamo un metodo per identificare gli inibitori della chinasi a piccole molecole che modulano l'apoptosi di timociti immaturi double-positivi CD4⁺CD8⁺ autoreattivi. L'apoptosi è indotta nei timociti doppi positivi attivandoli con sfere magnetiche rivestite anti-CD3 e anti-CD28; Segue un trattamento con inibitori di piccole molecole e un'analisi con citometria a flusso per rilevare se gli inibitori modulano l'espressione del marcatore apoptotico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Screening della libreria di inibitori della chinasi (test indipendente dalla centrifuga)

1. Trattamento dei timociti con inibitori delle chinasi
   1. Preparare una sospensione di timociti.
   2. Diluire i timociti in RPMI completo per ottenere una sospensione di timociti di 25 x 10⁶ cellule/mL.
   3. Aggiungere 40 μl di timociti a ciascun pozzetto di una piastra di piccolo volume, utilizzando una pipetta multicanale. Metti il piatto sul ghiaccio.
   4. Diluire gli inibitori dalla piastra madre, il DMSO e il desametasone in RPMI completo in un rapporto di quattro parti di RPMI completo per una parte di inibitore/DMSO/desametasone (fattore di diluizione di 5).
      nota: Poiché i volumi utilizzati in questa piastra di piccolo volume sono 5 volte più piccoli rispetto al metodo convenzionale, gli inibitori e i reagenti di controllo vengono diluiti cinque volte prima di aggiungerli ai timociti nella piastra.
   5. Aggiungere 0,5 μl di inibitori delle chinasi alla piastra a 96 pozzetti dai pozzetti corrispondenti della piastra dell'inibitore preparata al punto 1.1.4.
   6. Preparare otto pozzetti di controlli non trattati. Preparare quattro pozzetti di controlli trattati con il veicolo aggiungendo 0,5 μl del DMSO preparato al punto 1.1.4. Preparare quattro pozzetti di controlli trattati con desametasone da 5 μM, utilizzando il desametasone diluito preparato al punto 1.1.4 (Figura 1).

2. Stimolazione dei timociti utilizzando perle anti-CD3/CD28

1. Assicurarsi che le perline siano risospese in modo uniforme. Prendi 1 mL di perline e lavale con 2 mL di PBS. Separare le perle utilizzando un supporto magnetico e aspirare la soluzione. Risospendere le perle in 1 mL di RPMI.
   nota: Il rapporto tra perle e celle è di 1 a 2,5. Regolare la quantità di perline, a seconda del numero di pozzetti da stimolare e del numero di timociti utilizzati.
2. Aggiungere 10 μl di sospensione di perline a ciascun campione trattato con inibitore, ai quattro campioni trattati con DMSO e a quattro degli otto campioni non trattati. Aggiungere 10 μl di RPMI completo ai restanti quattro pozzetti non trattati. La Figura 1 mostra il layout generale della targa.
   nota: Il volume finale dei pozzetti è di 50 μL, che rientra nella capacità massima dei pozzetti. È importante prestare attenzione e tenere le piastre in posizione verticale, per evitare fuoriuscite di pozzetti trasversali.
3. Per mescolare, agitare la piastra utilizzando un agitatore orbitale per micropiastre. In alternativa, miscelare il contenuto dei pozzetti utilizzando una pipetta multicanale.
4. Incubare i timociti in un incubatore a 37 °C, CO₂ al 5% per 17 - 20 ore (o durante la notte) con un coperchio anti-evaporazione.

3. Configurazione della lavatrice per piastre

NOTA: Le istruzioni per l'installazione della lavapiatti sono fornite dal produttore. I passaggi sono menzionati brevemente di seguito. Sono necessari circa 150 mL di soluzione per ogni fase di adescamento.

1. Adescare il sistema di lavaggio con etanolo al 70% contenente l'1% di Tween 20.
2. Adescare il sistema di lavaggio con acqua deionizzata contenente l'1% di Tween 20.
3. Adescare il sistema di lavaggio con tampone di lavaggio FACS.

4. Colorazione degli antigeni di superficie

1. Preparare una miscela colorante di anticorpi contenente anticorpi anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD69. Diluire gli anticorpi nel tampone di lavaggio FACS in un rapporto di 1:100 (v/v).
2. Lavare la piastra 9 volte, utilizzando 55 μl di tampone di lavaggio FACS per lavaggio, utilizzando il sistema di lavaggio a flusso laminare automatizzato.
   nota: Al termine dei lavaggi, ci saranno 25 μL di volume residuo in ogni pozzetto.
3. Risospendere le cellule in 25 μl della miscela di anticorpi coloranti preparata al punto 1.4.1.
4. Se i campioni vengono trasferiti da una piastra a 96 pozzetti, risospendere le cellule in 50 μl della miscela di anticorpi e trasferire i campioni nella piastra di piccolo volume. Questo passaggio corrisponde al metodo numero 2, come illustrato nella Figura 2A.
5. Per la miscelazione, agitare la piastra con un agitatore orbitale per micropiastre o miscelare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e incubare su ghiaccio per 30 minuti.

5. Fissazione delle cellule

1. Lavare la piastra 9 volte, utilizzando 55 μL di tampone di lavaggio FACS per lavaggio, utilizzando il sistema di lavaggio a flusso laminare automatizzato.
2. Aggiungere il tampone di fissazione/permeabilizzazione (fornito con il kit per l'apoptosi della caspasi-3 attiva; lo stesso vale per il tampone 10x per la permanente/lavaggio menzionato al punto 1.6.1 e l'anticorpo anti-caspasi-3 al punto 1.6.2) a 50 μl per pozzetto.
3. Incubare con ghiaccio per 30 min.

6. Colorazione intracellulare per caspasi attiva 3

1. Preparare 1x tampone permanente/lavaggio diluendo 25 mL di 10x tampone permanente/lavaggio in 225 mL di acqua ultrapura.
2. Preparare la colorazione intracellulare attiva della caspasi aggiungendo 1 mL di anticorpo anti-caspasi-3 a 2 mL di 1x tampone permanente/lavaggio. Il rapporto tra anticorpo e tampone permanente/lavaggio è 1:2.
3. Adescare il sistema di lavaggio con 1x permanente/tampone di lavaggio.
4. Lavare la piastra 9 volte con 1 tampone permanente/lavaggio, a 55 μl per ogni lavaggio.
5. Aggiungere 25 μl del colorante intracellulare della caspasi preparato al punto 1.6.2 in tutti i pozzetti.
6. Per la miscelazione, agitare la piastra con un agitatore orbitale per micropiastre o miscelare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e incubare su ghiaccio per 1 ora.
7. Lavare la piastra 9 volte con 1 tampone permanente/lavaggio, a 55 μl per ogni lavaggio.
8. Aggiungere 25 μl di tampone di lavaggio FACS a tutti i pozzetti.
9. Trasferire i campioni in provette per microtitolazione dopo un'adeguata miscelazione tramite pipettaggio.
10. Aggiungere altri 50 μl di tampone di lavaggio FACS ai pozzetti vuoti e ripetere il passaggio 1.6.9.
11. Ripetere i passaggi 1.6.9 e 1.6.10 2 volte fino a quando 200 μL di campioni vengono raccolti nelle provette per microtitolazione.
    nota: Lo scopo delle procedure descritte nelle fasi 1.6.10 e 1.6.11 è quello di garantire il massimo recupero delle cellule dalla piastra di piccolo volume. Se il numero di cellule non è un problema, dopo il passaggio 1.6.10, è sufficiente rabboccare le provette per microtitolazione a 200 μl con il tampone di lavaggio FACS.
12. Eseguire un'analisi citofluorimetrica dei campioni e analizzare i risultati con un programma di analisi FACS. L'attivazione della caspasi-3 e l'espressione di CD69 sono analizzate nel gate contenente timociti CD4+CD8+DP.

Risultati

Figura 1: Disposizione delle piastre del saggio di attivazione dei timociti. (Inizio) Le colonne 1 e 12 sono riservate ai controlli, mentre le colonne da 2 a 11 sono campioni trattati con inibitori (beige). Il controllo negativo (NS non stimolato; grigio) occupa i pozzetti da A1 a D1, mentre il controllo positivo per la morte cellulare (DEX trattato con desametasone; viola) occupa i pozzetti da E1 a H1. Le colonne da 2 a 12 contengo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Giri di velocità	HyClone	SH30027FS
FBS	HyClone	SH3007103
L-Glutammina	HyClone	SH3003401
Piruvato di sodio	HyClone	SH3023901
10X PBS	Vivantis	PB0344 – 1L
Libreria di screening delle chinasi (96 pozzetti)	Cayman Chimica	Codice 10505	Il contenuto esatto della libreria può variare
Dmso	Sigma Aldrich	D2650
desametasone	Sigma Aldrich	D4902
perline anti-CD3/CD28	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11452D
Kit per l'apoptosi FITC Active Caspase-3	BD Pharmingen	Codice: 550480	Contiene tampone di fissazione/permeabilizzazione, tampone 10X Perm/Wash e anticorpi anti-caspasi 3
Rondella DA-Cell	CURIOX	HT1000
Piastra per celle DA a 96 pozzetti	CURIOX	96-DC-CL-05
anticorpi
CD3e	BioLeggenda	100236
TCRb	BD Bioscienze	553174
CD4	BD Bioscienze	740007
CD8	BD Bioscienze	563786
CD69	eBioscience	Codice 25-0699-42
Inibitori
TG003	Cayman Chimica		Dalla libreria di screening delle chinasi
TG003	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PKC 412	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Doramapimod	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Paclitaxel	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Erlotinib	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Necrostatina-5	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
NVP-BEZ235	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Ftalazinone pirazolo	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-879	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
1-NA-PP1	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Torin 1	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Bisindolilmaleimmide II	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
BIBF 1120	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SMI-4a	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Bisindolilmaleimmide XI (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10657	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AS-703026	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Cloruro di chelerytrina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Tunicamicina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
GSK 1059615	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Ruxolitinib	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Necrostatina-1	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SB 505124	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
INCHIOSTRO128	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Canertinib (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SB 431542	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PD 173074	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Acido valproico (sale sodico)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PD 0325901	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SB 203580	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
VX-702	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Emodina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CHIR99021	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
bio	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Imatinib (mesilato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Sunitinib malato	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Gefitinib	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PP2	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
3-metiladenina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Bisindolilmaleimmide I	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Bisindolilmaleimmide IV	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Bisindolilmaleimmide V	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
NSC 663284	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
D 4476	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
NU 7026	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
H-9 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Indirubina-3'-monoxima	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
KN-62	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
KN-93	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Codice CGP 57380	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Iso-Olomoucine	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
(S)-glicil-H-1152 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Bisindolilmaleimmide VIII (acetato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
ST638	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SU 6656	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
LY364947	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SB 203580 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10621	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
YM-201636	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
ZM 447439	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Codice AS-041164	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
NVP-AEW541 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PP242	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
ABT-869	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10622	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
17β-idrossi Wortmannin	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10626	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SU 6668	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10572	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
N,N-dimetilsfingosina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
LY294002	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
U-0126	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Staurosporina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
KN-92 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AS-605240 (sale di potassio)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
O-1918	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Y-27632 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Lelamine	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PD 98059	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PD 169316	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
TGX-221	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
(S)-H-1152 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AS-605240	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
D-eritro-sfingosina C-18	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
OSU03012	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
JNJ-10198409	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Lelalamina (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Leelamide dell'acido arachidonico	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Leelamide dell'acido laurico	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AS-252424	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10505	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PI-103	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PIK-75 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Inibitore della sfingosina chinasi 2	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Piceatannol	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SC-1	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
(R)-Roscovitina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
BAIA-43-9006	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10561	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AS-604850	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Inibitore della PI3-chinasi α 2	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Missili ML-9	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Triciribina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Erbstatina analogica	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Kenpaullone	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Olomoucine	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-494	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-825	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-1478	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SB 216763	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SB 415286	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-17	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
H-8 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
LFM-A13	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SC-514	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Apigenina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-18	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10554	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
DRB	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
RG-13022	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
RG-14620	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-490	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-82	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-99	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-213	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-183	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Lavendustin C	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
ZM 336372	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
5-iodotubercidina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SB 202190	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10571	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Nilotinib	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
SP 600125	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
L-treo-sfingosina C-18	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
H-89	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
HA-1077 (cloridrato)	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-370	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Mostmannina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
AG-1296	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
KT 5823	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Gennaio 1	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10574	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10575	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10576	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
NH125	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Scarpe TWS119	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
NSC 210902	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10577	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CAY10578	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
PD 184161	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
CCT018159	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi
Miricetina	Cayman Chimica	-	Dalla libreria di screening delle chinasi