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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Derivazione e attivazione dei macrofagi del midollo osseo con anticorpi
- Eseguire l'eutanasia utilizzando l'asfissia da CO2.
- Posiziona il mouse nella camera di induzione. Eutanasia del topo con anestesia con isoflurano al 5%, per 60-90 s, fino a quando non si è immobilizzati e la respirazione è profonda e lenta.
- Interrompere l'anestesia con isoflurano e somministrare 6 - 8 L/min di CO2 fino a quando il topo non ha smesso di respirare. Lasciare acceso il mouse con CO2 per almeno altri 5 minuti. Verificare che non ci sia più battito cardiaco o respirazione. Eseguire una lussazione cervicale per garantire la morte.
NOTA: I topi di 8 - 12 settimane forniscono la più alta resa di macrofagi.
- Spruzzare le zampe del mouse con etanolo al 70% e fissarle con le braccia e le gambe distese in posizione supina su un pannello di schiuma. Con forbici e pinze per tenere la pelle, fai un taglio poco profondo (0,2 cm) per rimuovere la pelle e il pelo dalla superficie di ciascuna delle zampe posteriori.
nota: Eseguire questa procedura e tutte le manipolazioni di colture tissutali in una cappa sterile.
- Taglia i muscoli per rendere visibili tibie e femori. Rimuovere le tibie e i femori, tagliando l'osso e i muscoli appena sotto l'articolazione dell'anca e sopra le caviglie. Taglia più muscoli possibile.
- Spruzzare le ossa con etanolo al 70% e attendere 1 minuto affinché evapori, quindi posizionarle in una piastra a 6 pozzetti di terreno di lavaggio osseo (terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM), siero fetale bovino al 10% (FBS)).
- Taglia le estremità delle ossa tagliando 0,1 cm di osso dalla caviglia e dalla parte superiore del femore in modo che la cavità ossea sia esposta. Assicurarsi che il midollo sia visibile e che un ago calibro 26 possa essere inserito nella cavità ossea.
- Taglia le ossa e i muscoli per separare le tibie e i femori dalle articolazioni del ginocchio. Inserire nella cavità un ago calibro 26 collegato a una siringa da 10 ml. Lavare il midollo osseo in una provetta conica da 50 mL con 5 mL di terreno di lavaggio osseo. Inserire due tibie e due femori, da un topo, in ciascuna provetta da 50 ml.
- Pipettare su e giù più volte o agitare il midollo a bassa velocità per disperdere delicatamente i grumi. I fili di midollo devono essere spezzati in piccole (meno di 0,5 mm) macchie di midollo. Riempire la provetta conica fino a 50 mL con il terreno di lavaggio osseo. Pipettare il contenuto della provetta conica in un pallone da 75 cm2 trattato con coltura tissutale e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 1 h.
nota: I macrofagi maturi e le cellule mesenchimali diventeranno aderenti al pallone e saranno scartati, mentre i progenitori ematopoietici desiderati rimarranno in sospensione.
- Pipettare il terreno con i progenitori ematopoietici in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare la provetta a 300 x g a temperatura ambiente per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno di coltura con fattore stimolante le colonie di macrofagi (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 150 μM di monotioglicerolo (MTG)).
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Aggiungere il terreno per risospendere le cellule a una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL, 1,5 x 107 cellule/matraccio in 30 mL di terreno e pipettare delicatamente su e giù. Pipettare 30 mL di sospensione in un nuovo matraccio da 75 cm2 trattato con coltura tissutale.
- Il giorno 4 e il giorno 7 dopo la coltura iniziale nella fase 1.9, verificare che le cellule siano aderenti e leggermente ramificate utilizzando un microscopio a campo chiaro a contrasto di fase invertito. Scartare il terreno contenente le cellule non aderenti. Lavare le cellule con IMDM una volta e aggiungere 30 ml di terreno di coltura MCSF.
- Quando le cellule sono mature entro il giorno 10 (>95% positivo per F4/80 e Mac-1), verificare nuovamente che le cellule siano aderenti e leggermente.
- Per piastrare le cellule per la stimolazione, rimuovere il terreno di coltura dal pallone e aggiungere 8 mL di tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi e a base di EDTA (Tabella dei materiali). Incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C, 5% CO2.
- Raschiare delicatamente le cellule, con una piccola pressione, utilizzando un raschietto per cellule sterile. Controllare al microscopio che le cellule si siano staccate dalla superficie del pallone. Pipettare le cellule dissociate in una provetta conica da 50 mL. Sciacquare il matraccio 3 volte con 5 ml di IMDM e unire la soluzione di risciacquo con le cellule raccolte. Centrifugare le celle a 300 x g a temperatura ambiente per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di terreno di coltura MCSF per provetta conica da 50 mL. Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro. Risospendere le cellule a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL e piastra 100 μL di sospensione cellulare (1 x 105 cellule/pozzetto) per pozzetto di una piastra a fondo piatto trattata con coltura tissutale a 96 pozzetti.
nota: Le ossa di un topo genereranno abbastanza cellule per 100 pozzetti. Se lo si desidera, è possibile colorare 1 mL di cellule in una piastra a 6 pozzetti (trattamento con coltura tissutale, fondo piatto). Un numero maggiore di cellule (1 x 106 cellule) può essere utile per le analisi di western blot.
- Una volta aderiti, stimolare pozzetti duplicati o triplicati ciascuno con 10 ng/mL di LPS in IMDM, 30 mg/mL di IVIg o IVIg + LPS. Le dosi di LPS o IVIg possono essere titolate per ottimizzare le risposte. Lasciare i pozzetti duplicati o triplicati come controlli non stimolati. Incubarli per 24 ore (37 °C, 5% CO2).
nota: Le cellule ripiastrate devono aderire ai pozzetti di coltura tissutale entro 1 ora.
- Raccogliere i surnatanti cellulari da ciascun pozzetto in singole provette da microcentrifuga da 1,7 mL e rimuovere il particolato centrifugando a 10.000 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante della cella ed evitare di disturbare il pellet. Porre il surnatante cellulare chiarificato in una provetta da microcentrifuga sterile.
nota: I surnatanti cellulari possono essere analizzati per le citochine, IL-10 e la subunità delle citochine, IL-12/23p40, mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) immediatamente o conservati a -80 °C a lungo termine. Segui il protocollo ELISA da un kit disponibile in commercio (Tabella dei materiali). Altre citochine pro-infiammatorie possono essere dosate, come IL-6 e TNF, poiché sono anch'esse ridotte dal co-trattamento con stimolazione IVIg + LPS rispetto alla stimolazione con LPS da solo. Dopo la stimolazione, le cellule aderenti possono essere preparate per tecniche come il western blotting o la reazione a catena quantitativa della polimerasi (Q-PCR).