Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Sfida ai topi in vivo con immunoglobuline e lipopolisaccaridi per via endovenosa (IVIg+LPS) e raccolta di macrofagi peritoneali
- Pesa ogni topo. Calcolare il volume di IVIg (100 mg/mL di concentrazione madre) necessario per fornire una dose finale di 2,5 g/kg di peso corporeo. Calcolare la quantità di LPS (100 μg/mL di concentrazione madre nel terreno di Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove) necessaria per fornire una dose finale di 0,2 μg/g di peso corporeo.
nota: Ad esempio, per un topo da 20 g, sono necessari 500 μL di soluzione madre IVIg e 40 μL di una soluzione da 100 μg/mL di LPS.
- Aspirare la quantità necessaria di IVIg e LPS in una siringa sterile da 1 ml dotata di un ago sterile calibro 26. Per i topi di controllo che non riceveranno IVIg, sostituire un volume equivalente di IVIg con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4.
- Accarezza il topo con una mano afferrando la sua pelle nella parte posteriore del collo con il pollice e l'indice e tenendo la coda e le zampe posteriori con le dita rimanenti. Inclina il suo corpo verso il suolo.
- Posizionare l'ago con un angolo di 30 - 40° rispetto all'addome del topo, nel quadrante inferiore destro, smussare verso l'alto e inserire 1,5 cm. Iniettare IVIg + LPS, o PBS + LPS, per via intraperitoneale.
- Dopo 1 ora, eseguire l'eutanasia utilizzando l'asfissia da anidride carbonica (CO2).
- Posiziona il mouse in una camera di induzione. Eutanasia del topo con anestesia con isoflurano al 5%, per 60-90 s, fino a quando non si è immobilizzati e la respirazione è profonda e lenta.
- Spegnere l'anestesia con isoflurano e somministrare 6-8 L/min di CO2 fino a quando il topo non ha smesso di respirare. Lasciare acceso il mouse con CO2 per almeno altri 5 minuti. Verificare che non ci sia più battito cardiaco o respirazione. Eseguire una lussazione cervicale per garantire la morte.
NOTA: I topi di 8 - 12 settimane forniscono la più alta resa di macrofagi.
- Appunta il mouse a una tavola di gommapiuma, con gli arti divaricati. Spruzzare le parti con etanolo al 70%.
nota: Eseguire la procedura in una cappa sterile.
- Fai un taglio superficiale nella pelle (0,2 cm) con le forbici lungo la linea mediana del topo, per evitare di tagliare la cavità peritoneale. Estrarre la pelle addominale dalla pancia del topo usando una pinza, in modo che il rivestimento della parete peritoneale intatta sia visibile.
- Riempire una siringa da 5 mL con 5 mL di PBS sterile (pH 7,4). Inserire un ago calibro 25 o 27 nella parte superiore della cavità dal lato sinistro o destro verso il centro del mouse con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto.
nota: Posiziona con cura l'ago nel mouse in modo da non iniettare PBS negli organi, ma piuttosto nello spazio peritoneale.
- Spingere il fluido nella cavità peritoneale. Estrarre l'ago dalla cavità e massaggiare il peritoneo per 10 s per rimuovere eventuali cellule. Inserire l'ago nella parte superiore della cavità ed evitare gli organi. Raccogliere e versare il liquido di lavaggio recuperato in una provetta conica da 15 mL su ghiaccio.
nota: Per ogni 5 mL di liquido iniettato, verranno recuperati circa 3,75 mL.
- Ripetere l'iniezione e il recupero (fasi 1,8 - 1,9) altre 3 volte (volume totale di iniezione di 20 ml), per recuperare 15 ml di liquido di lavaggio in totale. Raccogliere il lavaggio da ciascun topo in una provetta conica separata da 15 mL.
nota: Dopo l'iniezione finale, potrebbe essere più facile estrarre il fluido dai lati sinistro e destro del topo, dove si è accumulato il liquido. Gli organi causeranno meno interferenze con l'ago in questa posizione.
- Centrifugare le cellule verso il basso a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere 1 mL di liquido di lavaggio recuperato e utilizzarlo per analisi di interleuchina o IL-10 e IL-12/23p40 mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) secondo le istruzioni del produttore o congelare a -80 °C per analisi future.
nota: Per garantire un confronto accurato tra i trattamenti per l'analisi delle citochine del liquido di lavaggio, eseguire 5 mL di lavaggio della cavità peritoneale 4 volte per un volume finale di 15 mL. Non tutto il liquido verrà recuperato da ogni lavaggio.
- Risospendere le cellule in 500 μL di terreno di placcatura (IMDM, 10% siero fetale bovino, FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina) per topo lavato. Contare i macrofagi vitali.
nota: I macrofagi saranno leggermente più grandi delle altre cellule peritoneali. La resa tipica è di 5 x 105 - 1 x 106 macrofagi/topo utilizzando un topo C57BL/6 wild-type.
opzionale: Se nel pellet cellulare è presente un numero elevato di globuli rossi, eseguire una fase di lisi secondo le istruzioni del produttore per rimuoverli.
- Risospendere le cellule nel terreno di placcatura a 1 x 106 macrofagi/mL e la piastra a 100 μL per pozzetto in una piastra trattata con coltura tissutale a fondo piatto a 96 pozzetti.
nota: Potrebbe essere necessario raggruppare le cellule di più di un topo per un esperimento. Ad esempio, se un topo avesse 5 x 105 macrofagi, sarebbero necessari 500 μl di terreno di placcatura.
- Incubare le cellule per 1 ora a 37 °C, 5% di CO2 per consentire ai macrofagi di aderire. Le cellule aderenti sono i macrofagi peritoneali. Rimuovere i surnatanti cellulari e le cellule non aderenti. Sciacquare due volte i pozzetti con 200 μl di IMDM (preriscaldato a 37 °C), attendere 10 s e inclinare lentamente la piastra. Sostituire il mezzo di placcatura. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 30 minuti prima della stimolazione.
- Una volta aderiti, stimolare pozzetti duplicati o triplicati ciascuno con 10 ng/mL di LPS in IMDM, 30 mg/mL di IVIg o IVIg+LPS. Le dosi di LPS o IVIg possono essere titolate per ottimizzare le risposte. Lasciare i pozzetti duplicati o triplicati come controlli non stimolati. Incubarli per 24 ore (37 °C, 5% CO2).
nota: Le cellule ripiastrate devono aderire ai pozzetti di coltura tissutale entro 1 ora. I campioni possono essere utilizzati immediatamente o congelati e conservati a -80 °C per l'analisi delle citochine mediante ELISA.
- Raccogliere i surnatanti cellulari da ciascun pozzetto in singole provette da microcentrifuga da 1,7 mL e rimuovere il particolato centrifugando a 10.000 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante della cella ed evitare di disturbare il pellet. Porre il surnatante cellulare chiarificato in una provetta da microcentrifuga sterile.
nota: I surnatanti cellulari possono essere analizzati per le citochine, IL-10, e la subunità delle citochine, IL-12/23p40, mediante ELISA immediatamente, o conservati a -80 °C a lungo termine. Seguire il protocollo ELISA del kit disponibile in commercio (Tabella dei materiali). Altre citochine pro-infiammatorie possono essere dosate, come l'IL-6 e il fattore di necrosi tumorale (TNF), poiché sono anch'esse ridotte dal co-trattamento con la stimolazione IVIg+LPS rispetto alla stimolazione con il solo LPS. Dopo la stimolazione, le cellule aderenti possono essere preparate per tecniche come il western blotting o la reazione a catena quantitativa della polimerasi (Q-PCR).
