Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Immunizzazione dei topi
- Preparare una miscela di vaccini master in un tampone fisiologico sterile come soluzione fisiologica o DPS.
nota: Il volume totale della miscela dovrebbe includere il 10% in più di quello richiesto per l'immunizzazione dell'intero gruppo. Le concentrazioni della composizione del vaccino sono descritte di seguito nelle fasi 1.1.1 e 1.1.2. Trasporta gli oggetti al vivaio con ghiaccio.
- Per gli studi su B. pertussis, includere i seguenti gruppi di vaccini: vaccino acellulare contro la pertosse (aPV) e aPV + fattore di colonizzazione A della Bordetella (BcfA). Inoltre, utilizzare allume, antigeni vaccinali da soli (emoagglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (Prn)) e topi naive (non immunizzati) come gruppi di controllo><.
NOTA: l'aPV è 1/5 della dose umana di un aPV approvato dalla FDA, che è composto da tossoide del tetano, tossoide difterico ridotto, tossoide della pertosse (PT), emoagglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (Prn) adsorbita ai sali di alluminio. Una dose umana di pertosse aPV attuale è di 0,5 ml, quindi 1/5 di dose è 0,1 ml. I volumi per aPV + BcfA sono 0,1 mL di aPV (1/5 della dose nell'uomo) + 0,046 mL di BcfA (30 μg) per topo. Il volume massimo che può essere erogato in sicurezza a un muscolo è di 0,1 ml. Poiché il volume del vaccino aPV + BcfA è superiore a 0,1 ml, il vaccino deve essere somministrato in entrambe le spalle, diviso approssimativamente in parti uguali, per essere somministrato in sicurezza.
- Per preparare un vaccino sperimentale, per una dose combinare 1 μg di FHA e 0,5 μg di Prn con 50 μg di gel di idrossido di alluminio in PBS sterile. Lasciare miscelare l'aPV sperimentale su un rullo da laboratorio per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Successivamente, centrifugare la provetta a 18.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il contenuto in 1 mL di PBS sterile.
- Nel vivaio, installare la macchina per anestesia (Figura 1).
nota: Assicurarsi che ci siano livelli adeguati di ossigeno e isoflurano nei rispettivi serbatoi prima dell'uso. Pesare il contenitore scavenger di isoflurano e sostituirlo quando il suo peso aumenta di 50 g.
- Pulire accuratamente la cabina di sicurezza biologica (BSC) e posizionare la camera di induzione pulita all'interno della BSC. Collegare le linee di anestesia e scavenger dalla macchina per anestesia alla camera di induzione. Aprire il serbatoio dell'ossigeno tramite il regolatore per assicurarsi che l'ossigeno fluisca e impostare il livello su 1,5-2 L/min.
- Posizionare i topi dell'età desiderata (6-12 settimane) nella camera di induzione. Attivare l'isoflurano al 2,5-3% per anestetizzare leggermente i topi. Monitorare gli animali fino a quando non si muovono nella camera e la loro respirazione è rallentata.
- Testare il livello di induzione pizzicando le dita dei piedi, osservando eventuali movimenti riflessivi. Se non ce n'è, allora i topi sono pronti per l'iniezione.
NOTA: In questo esperimento, l'intera gabbia degli animali è stata anestetizzata immediatamente. Si può scegliere di anestetizzare gli animali individualmente per l'iniezione o di iniettare gli animali senza anestesia. Entrambi questi metodi sono appropriati.
- Nel frattempo, preparare siringhe da insulina da 1 ml (28G1/2) con 0,1 ml di vaccino ciascuna. Quando gli animali sono completamente indotti, rimuovere un animale dalla camera e adagiare il topo ventralmente su un asciugamano o un banco.
- Somministrare il vaccino per via intramuscolare. Con la siringa a un angolo di 45° e con lo smusso rivolto verso l'alto, inserire la siringa ~5 mm nel deltoide del topo e iniettare il vaccino.
nota: Il quarto posteriore/fianco può essere utilizzato come sito di iniezione al posto del deltoide.
- Dopo l'iniezione, tenere l'ago inserito nel muscolo per ~5-10 s. Una volta erogato il volume, ruotare la siringa di 180° in modo che lo smusso sia rivolto verso l'esterno per creare una tenuta e prevenire la fuoriuscita del vaccino. Quindi, estrarre lentamente l'ago dal sito di iniezione.
- Rimetti il mouse nella gabbia. Ripetere la procedura con tutti gli animali del gruppo designato.
- Spegnere l'isoflurano e lavare la camera di induzione con l'ossigeno prima di anestetizzare la prossima gabbia di topi.
- Monitora gli animali fino a quando non sono tutti vigili e si muovono nella gabbia. Riportare la gabbia nella posizione di alloggiamento.
- Monitorare gli animali ogni 12 ore dopo la vaccinazione, fino a 48 ore, per sintomi clinici di morbilità come pelo ruvido/trasandato, andatura lenta o respirazione affannosa. Se i sintomi persistono, consultare il veterinario istituzionale e, se necessario, rimuovere i topi dallo studio.
- Quattro settimane dopo l'immunizzazione iniziale, potenziare i topi anestetizzando e somministrando iniezioni intramuscolari nel deltoide destro del topo con la stessa formulazione vaccinale precedentemente somministrata.
- Ancora una volta, monitorare l'animale per eventuali sintomi clinici. Ospita gli animali per altre 2 settimane e poi procedi con l'infezione.
2. Modello di infezione intranasale murina
- Nel vivaio, impostare le condizioni di ossigeno e anestesia come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4. Come descritto nel passaggio 1.5, posizionare i topi nella camera per anestetizzarli. Monitorare gli animali fino a quando l'anestesia non fa effetto.
- Quando i topi sono anestetizzati, rimuovere un animale alla volta dalla camera di induzione. Prendi il topo per la collottola del torace dorsale, dietro le scapole e il collo. Posiziona il mouse in posizione verticale per accedere al naso.
- Utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl, applicare lentamente 40-50 μl di inoculo batterico di B. pertussis sulle narici del topo (20-25 μl in ciascuna nare). Tieni premuto il topo fino a quando l'intero inoculo non è stato inalato dall'animale. Se una parte dell'inoculo fuoriesce, raccogli le bolle e instillale nuovamente nelle narici. Somministrare una quantità uguale di PBS sterile a un gruppo di topi come controllo negativo.
- Come fatto nei passaggi 1.10-1.12, riportare gli animali inoculati nella loro gabbia e monitorare gli animali fino a quando non sono vigili e in movimento. Riportare la gabbia nello spazio di alloggiamento originale sul rack. Lavare la camera di induzione con ossigeno per rimuovere l'isoflurano residuo prima di anestetizzare il successivo gruppo di animali. Monitorare gli animali per 48 ore dopo l'infezione.
- In laboratorio, piastre diluizioni seriali dell'inoculo, in PBS sterile, per verificare le effettive unità formanti colonie (CFU) consegnate ai topi. Piastra 0,1 mL di diluizioni su piastre BG + Sm al 10% (piastre di agar Bordet-Gengou integrate con sangue di pecora defibrato al 10% e streptomicina 100 μg/mL) (Figura 2A). Mettere le piastre nell'incubatrice a 37 °C e far crescere per 4 giorni. Contare e calcolare le CFU dall'inoculo somministrato al topo (Figura 2B).
3. Raccolta di tessuti animali dopo l'infezione
- Prepararsi per la dissezione del topo e la raccolta dei tessuti.
- Sterilizzare tutti gli strumenti (forbici grossolane e fini, forbici curve, pinze fini, pestelli per pellet e divaricatori triangolari) necessari per la lavorazione dei tessuti in autoclave. Sigillare gli strumenti nelle buste di sterilizzazione. Avvolgere gli omogeneizzatori di vetro in un foglio di alluminio e aggiungere del nastro adesivo per autoclave per indicare la sterilità.
- Preparare le piastre di agar 1 o 2 giorni prima del prelievo dei tessuti per assicurarsi che le piastre siano solidificate prima dell'uso. Per B. pertussis, utilizzare il 10% di BG + Sm. Piastre di etichettatura per il polmone per ciascun topo con le diluizioni desiderate, determinate empiricamente per ogni esperimento.
- Riempire ed etichettare le provette di diluizione CFU. Aggiungere 0,9 mL di PBS sterile a provette sterili da microcentrifuga da 1,5 mL in base al numero di organi da processare e alle diluizioni per organo.
- Provette di riempimento ed etichettatura per la raccolta dei tessuti:
- Polmoni: aggiungere 2 mL di caseina sterile all'1% in PBS in una provetta conica sterile da 15 mL e conservare a 4 °C. Per prelevare i polmoni per l'istologia, aggiungere 2 mL di formalina tamponata neutra (NBF) al 10% e conservarla in RT.
- L'etanolo fresco al 70% deve essere preparato per riempire i becher e i flaconi spray per la dissezione.
- Trasporta tutti i materiali al vivaio su un carro il giorno del raccolto. Pulire il BSC e impostare la macchina per anestesia come nei passaggi 1.3 e 1.4.
- Posizionare i topi da sezionare nella camera di induzione e, con l'ossigeno che scorre, accendere l'isoflurano al 5% e attendere che gli animali siano incoscienti. Rimuovi i topi uno alla volta e disloca cervicale l'animale come metodo secondario per garantire la morte. Dopo la lussazione cervicale, l'eutanasia deve essere confermata dall'assenza di frequenza respiratoria e/o dall'assenza del riflesso di ritiro (test del pizzicamento delle dita).
- Posizionare il mouse, con il lato ventrale rivolto verso l'alto, sulla tavola di dissezione e bloccare le braccia e le gambe aperte. Spruzzare sul corpo del topo con etanolo al 70%.
- Usando una pinza, afferra la pelle sotto l'addome, al centro del bacino. Usando le forbici affilate, fai un taglio verticale fino alla mandibola. Quindi, sezionare la pelle lontano dalla parete peritoneale allontanando i due strati, con piccoli movimenti con le forbici chiuse. Posiziona la pelle ai lati della carcassa per creare un campo libero per il prelievo sterile di organi.
- Usa una pinza per stabilizzare la gabbia toracica durante il processo xifoideo e apri il diaframma. I polmoni dovrebbero sgonfiarsi e cadere verso la colonna vertebrale. Tagliare la gabbia toracica ai lati per rimuovere il pettorale.
- Isolare e rimuovere il lobo superiore del polmone destro, tagliando le arterie polmonari e le vene. Posizionare il lobo in una provetta conica da 15 mL contenente il 10% di NBF e posizionare la provetta in RT per almeno 24 ore per fissare il tessuto. Isolare i lobi rimanenti del polmone destro e del polmone sinistro. Mettere i lobi in una provetta conica da 15 mL contenente 2 mL di caseina all'1% in PBS e metterli sul ghiaccio.
- Smaltire la carcassa in un sacchetto per il rischio biologico. Prima di sezionare l'animale successivo, sciacquare gli strumenti con acqua deionizzata, quindi metterli in un bicchiere riempito con etanolo al 70%. Rimuovere gli strumenti, scrollarsi di dosso l'etanolo in eccesso, quindi procedere con la dissezione successiva.
- Seziona ogni topo seguendo i passaggi sopra menzionati.
- Processare i tessuti come descritto di seguito.
4. Elaborazione dei polmoni
- Trasferire i polmoni (in 2 mL di caseina all'1% in PBS) in un omogeneizzatore Dounce sterile da 15 mL. Usa un pestello per omogeneizzare i tessuti. Dissociare fino a quando non rimangono particelle di tessuto di grandi dimensioni. Riposizionare la sospensione omogeneizzata nella provetta originale da 15 mL.
- Rimuovere un'aliquota da 0,3 mL per le CFU di placcatura e centrifugare l'omogenato a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Raccogliere e aliquotare il surnatante in aliquote da 0,5 mL in provette per microcentrifuga pre-marcate. Conservare i campioni a -20 °C fino all'analisi delle citochine mediante ELISA.
- Preparare le diluizioni selezionate diluendo in serie 0,1 mL della sospensione polmonare omogeneizzata in provette di diluizione (0,9 mL di PBS sterile). Piastra da 0,1 mL di diluizioni scelte empiricamente su piastre pre-marcate al 10% BG + Sm e stendere utilizzando uno spandiconcime triangolare sterile.
- Incubare le piastre a 37 °C all'aria ambiente per 4 giorni.
- Contare e calcolare le CFU/polmone (Figura 3). In breve, moltiplicare i numeri di CFU recuperati per il fattore di diluizione della piastra, quindi anche per il volume totale in cui l'organo è stato processato. I calcoli dei CFU vengono poi trasformati in valori Log10 per ogni animale e rappresentati graficamente.
- Le piastre con 30-300 colonie sono facilmente e accuratamente contate. Le piastre con meno di 6 colonie non dovrebbero essere utilizzate per i calcoli poiché un numero così basso di colonie introduce errori. Per ottenere un limite inferiore di rivelazione, il volume totale in cui un organo è stato omogeneizzato viene diviso per il volume utilizzato per individuare su una piastra dall'omogenato non diluito (ad esempio, 2 mL di volume totale diviso per 0,1 mL di omogenato non diluito equivale al limite inferiore di 20 CFU rilevabili).
