NOTA: I seguenti passaggi sono stati eseguiti utilizzando le celle IIA1.6 B.
1. Attivazione delle cellule B con perle rivestite di antigene
- Preparazione di perle rivestite di antigene
- Per attivare le cellule B, utilizzare perle NH2 rivestite in modo covalente con antigene (perle rivestite di Ag), che vengono preparate utilizzando 50 μL (~20 x 106 perline) di 3 μm di perle NH2 con antigeni attivanti (BCR-ligando+) o non attivanti (BCR-ligando-).
- Per le cellule IIA1.6 B utilizzare il frammento anti-IgG-F(ab')2 come BCR-ligando+ e l'anti-IgM-F(ab')2 o l'albumina sierica bovina (BSA) come BCR-ligando-. Per attivare le cellule B primarie o la linea cellulare B IgM+, utilizzare anti-IgM-F(ab')2 come BCR-ligando+ e BSA come BCR-ligando-.
nota: Per evitare il legame dei ligandi al recettore Fc, utilizzare frammenti di anticorpi F(ab') o F(ab')2 invece di anticorpi a lunghezza intera.
- Per procedere con la preparazione delle perle rivestite di Ag, posizionare le perle in provette da microcentrifuga a basso legame proteico per massimizzare il recupero delle microsfere durante la manipolazione del campione. Aggiungere 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per lavare le perle e centrifugare a 16.000 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante.
- Risospendere le perle con 500 μL di glutaraldeide all'8% per attivare i gruppi NH2 e ruotare per 4 ore a temperatura ambiente (RT).
cautela: La soluzione madre di glutaraldeide deve essere utilizzata solo in una cappa chimica. Seguire le istruzioni riportate nella scheda di sicurezza dei materiali (MSDS).
- Centrifugare le perle a 16.000 x g per 5 minuti, rimuovere la glutaraldeide e lavare le perle altre tre volte con 1 mL di 1x PBS.
cautela: La soluzione di glutaraldeide deve essere smaltita come rifiuto chimico pericoloso.
- Risospendere le perle attivate in 100 μL di 1x PBS. Il campione può essere diviso in due provette per microcentrifuga a basso legame proteico: 50 μl per il ligando BCR+ e 50 μl per il ligando BCR.
- Per preparare la soluzione antigenica utilizzare due provette da microcentrifuga a basso legame proteico da 2 mL contenenti 100 μg/mL di soluzione antigenica in 150 μL di PBS: una provetta con BCR-ligando+ e l'altra con BCR-ligando-.
- Aggiungere 50 μl di soluzione di microsfere attivate a ciascuna provetta contenente 150 μl di soluzione antigenica, vortex e ruotare per una notte a 4 °C.
- Aggiungere 500 μL di 10 mg/mL di BSA per bloccare i restanti gruppi reattivi NH2 sulle microsfere e ruotare per 1 ora a 4 °C.
- Centrifugare le perle a 16.000 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Lavare le perline con 1 PBS freddo altre tre volte.
- Risospendere le perle attivate in 70 μL di 1x PBS.
- Per determinare la concentrazione finale di perle rivestite di Ag, diluire un piccolo volume di perle in PBS (1:200) e contare con un emocitometro. Quindi conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
nota: Le perle rivestite di Ag non devono essere conservate per più di 1 mese.
2. Preparazione dei vetrini coprioggetti in poli-L-lisina
- Prima del saggio di attivazione delle cellule B con perle rivestite di Ag, preparare vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina (PLL-coverslips). Utilizzare una provetta da 50 mL contenente 40 mL di soluzione di PLL allo 0,01% p/v e immergere i vetrini coprioggetti da 12 mm di diametro nella soluzione. Ruota durante la notte a RT.
- Lavare i vetrini coprioggetti con 1x PBS e lasciarli asciugare su un coperchio a 24 pozzetti coperto con pellicola di paraffina. Procedere con l'attivazione delle cellule B.
3. Attivazione delle cellule B
- Per avviare l'attivazione delle cellule B con le perline, diluire prima la linea cellulare IIA1.6 B a 1,5 x 106 cellule/mL nel terreno CLICK (RPMI-1640 integrato con 2 mM di L-Alanina-L-Glutammina + 55 μM di beta-mercaptoetanolo + 1 mM di piruvato + 100 U/mL di penicillina + 100 μg/mL di streptomicina) + 5% di siero fetale bovino inattivato termicamente [FBS]).
- Combinare 100 μl (150.000 cellule) di cellule IIA1.6 B con perle rivestite di Ag in un rapporto 1:1 in provette da 0,6 mL. Mescolare delicatamente con un vortice e seminare sui vetrini coprioggetti PLL. Incubare per diversi momenti in un incubatore per colture cellulari (37 °C / 5% CO2). I punti temporali di attivazione tipici sono 0, 30, 60 e 120 min. Per il tempo 0, posizionare i vetrini coprioggetti PLL nel coperchio della piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio. Aggiungere la miscela di perle rivestite di cellule Ag e incubare per 5 minuti sul ghiaccio.
nota: È importante miscelare a vortice invece di pipettare su e giù perché ciò potrebbe ridurre il numero di perle nel campione, a causa del loro accumulo nella punta di plastica della pipetta. Utilizzare perle rivestite con legante BCR come controllo negativo per ogni saggio. Si consiglia di attivare prima il tempo di incubazione più lungo e poi i punti temporali successivi. Calcolare gli intervalli di attivazione per i campioni in modo che siano pronti per il fissaggio allo stesso tempo.
- Aggiungere 100 μL di PBS freddo 1x a ciascun vetrino coprioggetti per fermare l'attivazione e continuare con il protocollo di immunofluorescenza.
