Attivazione delle cellule B su un vetrino coprioggetti rivestito di antigene

Abstract

Fonte: Ibañez-Vega, J., et al., Studiare la dinamica degli organelli nelle cellule B durante la formazione delle sinapsi immunitarie. (2019)

Questo video mostra l'attivazione delle cellule B in vitro. Il processo coinvolge l'interazione dell'antigene con i recettori delle cellule B, portando al rimodellamento del citoscheletro, alla formazione delle sinapsi immunitarie, al movimento dei lisosomi, all'internalizzazione dell'antigene, all'elaborazione e alla successiva presentazione sulle molecole MHC per l'attivazione delle cellule B.

Protocollo

1. Preparazione dei vetrini coprioggetti in poli-L-lisina

1. Prima del saggio di attivazione delle cellule B con perle rivestite di Ag, preparare vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina (PLL-coverslips). Utilizzare una provetta da 50 mL contenente 40 mL di soluzione di PLL allo 0,01% p/v e immergere i vetrini coprioggetti da 12 mm di diametro nella soluzione. Ruota durante la notte a RT.
2. Lavare i vetrini coprioggetti con 1xPBS e lasciare asciugare su un coperchio a 24 pozzetti coperto con pellicola di paraffina. Procedere con l'attivazione delle cellule B.

2. Attivazione delle cellule B su vetrini coprioggetti rivestiti di antigene

1. Preparazione di vetrini coprioggetti rivestiti di antigene
   1. Prima dell'attivazione, preparare la soluzione antigenica (1x PBS contenente 10 μg/mL di BCR-ligando+ e 0,5 μg/mL di CD45R/B220 anti-topo di ratto).
   2. NOTA: Prendere in considerazione la possibilità di preparare i vetrini coprioggetti il giorno prima del test. B220 migliora l'adesione delle cellule B, tuttavia, il BCR-Ligand+ è sufficiente per generare la risposta di diffusione.
   3. Posizionare il vetrino coprioggetti da 12 mm su un coperchio della piastra a 24 pozzetti coperto con pellicola di paraffina, aggiungere 40 μl di soluzione antigenica su ciascun vetrino coprioggetti e incubare a 4 °C per una notte. Sigillare la piastra per evitare l'evaporazione della soluzione antigenica.
   4. Lavare i vetrini coprioggetti con 1x PBS e asciugarli all'aria.
2. Attivazione delle cellule B
   1. Per avviare l'attivazione, diluire le cellule B IIA1.6 a 1,5 x 10⁶ cellule/mL in terreno CLICK + 5% FBS.
   2. Aggiungere 100 μL di cellule su un vetrino coprioggetti rivestito di antigene (Ag-coverslip) e attivarle per diversi punti temporali in un incubatore cellulare a 37 °C / 5% CO₂. I punti di attivazione tipici sono 0, 30 e 60 min.
      nota: Come nella sezione 1, si consiglia di iniziare con il punto di attivazione più lungo per fissare tutti i campioni contemporaneamente.
   3. Per il tempo 0, posizionare il coperchio della piastra a 24 pozzetti contenente il vetrino coprioggetti Ag sul ghiaccio e aggiungere le cellule. Incubare per 5 minuti con ghiaccio.
   4. Aspirare con cura il terreno su ciascun vetrino coprioggetti Ag e quindi aggiungere 100 μl di 1x PBS freddo per arrestare l'attivazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
IIA1.6 (variante A20) cellule di linfoma B di topo	ATCC	TIB-208	Linfoma murino a cellule B di origine Balb/c che esprime un BCR contenente IgG sulla sua superficie senza FcγIIR
CaCl2	Winkler	CA-0520
glicina	Winkler	BM-0820
HyClone Siero fetale bovino	Thermo Fisher Scientifico	SH30071.03	Inattivare il calore a 56 C per 30 min
Kcl	Winkler	PO-1260
NaCl	Winkler	SO-1455
Parafilm	M	P1150-2
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientifico	15140122	liquido
Poli-L-lisina	sigma	P8920	Diluire con acqua sterile
RPMI-1640	Industrie Biologiche	01-104-1A
Piruvato di sodio	Thermo Fisher Scientifico	11360070
Tubo 50 ml	Corning	353043
2-mercaptoetanolo	Thermo Fisher Scientifico	21985023
glutammina	Thermo Fisher Scientifico	35050061
Anticorpo IgG capra-anti-topo	Jackson ImmunoResearch	315-005-003	Ligando positivo IIA1.6