Effetto dell'anticorpo anti C-fms sull'osteoclastogenesi nelle cellule del midollo osseo di topo in vitro

Abstract

Fonte: Marahleh, A., et al. Effetto dell'anticorpo anti-c-fms sulla formazione di osteoclasti e sulla proliferazione del precursore degli osteoclasti in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, dimostriamo l'effetto di diverse concentrazioni di anticorpi anti-c-fms sull'osteoclastogenesi, che è il processo di formazione degli osteoclasti dai progenitori degli osteoclasti.

Protocollo

1. Generazione di BMM

1. Seminare 1 x 10⁷ cellule/10 mL in una piastra di coltura da 10 cm e aggiungere M-CSF 100 ng/mL. La concentrazione finale di M-CSF è di 100 ng/mL di terreno di coltura. Incubare la coltura a 37 °C, 5% CO₂ per 3 giorni.
2. Dopo 3 giorni, rimuovere il terreno di coltura, lavare energicamente le cellule con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) due volte per rimuovere le cellule non aderenti, aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,02% a temperatura ambiente in PBS e incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 5 minuti.
3. Staccare le cellule mediante pipettaggio accurato. Assicurarsi che le cellule siano state staccate osservando la coltura al microscopio (le cellule dovrebbero apparire arrotondate e fluttuanti nei terreni). Se le cellule rimangono attaccate, ripetere accuratamente il pipettaggio per staccarle. Quando le cellule sono state staccate, aggiungere 5 mL di α-MEM per inattivare la reazione.
4. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min. Scartare il surnatante e lavare con 5 mL di α-MEM.
5. Centrifugare a 300 x g per 5 min e risospendere il pellet in 10 mL di α-MEM.
6. Eseguire un conteggio delle celle.
7. Seminare 1 x 10⁶ cellule/10 mL in una piastra di coltura da 10 cm e aggiungere M-CSF 100 ng/mL. La concentrazione finale di M-CSF è di 100 ng/mL di terreno di coltura. Incubare la coltura a 37 °C, 5% CO₂ per 3 giorni.

2. Generazione di Osteoclasti da BMM come Precursori di Osteoclasti

1. Dopo 3 giorni, raccogliere le cellule attaccate che rappresentano BMM come precursori degli osteoclasti, seguendo i passaggi 1.2-1.7.
2. Seminare BMM a 5 x 10⁴ cellule/200 μL di α-MEM in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere RANKL per una concentrazione finale di 50 ng/mL o TNF-α per una concentrazione finale di 100 ng/mL. Aggiungere M-CSF per una concentrazione finale di 100 ng/mL a ciascun pozzetto.
3. Aggiungere l'anticorpo anti-c-fms (concentrazioni finali di 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) a ciascun pozzetto.
4. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 4 giorni. Cambia i media a giorni alterni per 4 giorni.

3. Colorazione resistente alla fosfatasi acida (TRAP) resistente al tartrato

1. Dopo 4 giorni di incubazione, aspirare delicatamente il terreno di coltura di ciascun pozzetto. Lavare ogni pozzetto una volta con 200 μL di temperatura ambiente 1x PBS.
2. Aggiungere 200 μl di formalina al 10% in ciascun pozzetto per la fissazione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Aspirare la formalina e lavare ogni pozzetto 3 volte con acqua deionizzata.
3. Aggiungere 200 μl di Triton X-100 allo 0,2% in PBS in ciascun pozzetto per la permeabilizzazione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Aspirare il Triton X-100 e lavare ogni pozzetto 3 volte con acqua deionizzata.
4. Aggiungere 200 μl di soluzione colorante TRAP in ciascun pozzetto. Visualizza la macchia al microscopio. Ci vorranno dai 10 ai 30 minuti perché la macchia si sviluppi correttamente.
5. Aspirare la macchia e lavare ogni pozzetto con acqua deionizzata 3 volte e asciugare all'aria. Conservarlo a temperatura ambiente per utilizzarlo in ulteriori osservazioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo anti-c-Fms			AFS98, un anticorpo monoclonale di ratto, antimurino, c-Fms (IgG2a)
RANKL	PEPROTECH	315-11	Ligando ricombinante murino, Fonte: E.coli
M-CSF			M-CSF umano ricombinante. 1/10 vol di surnatante di coltura di linea cellulare CMG14-12 a 5X106 cellule in un piatto di coltura in sospensione di 10 cm.
α-MEM	Wako		con L-Glutammina e rosso fenolo
Siero fetale bovino	Bioovest	S1820-500	Siero Fetale Bovino Origine Francese
Piatto di coltura	Corning		Piatto stile 100 mm x 20 mm
piastra a 96 pozzetti	Thermofisher Scientifico		Nun clon Delta superficie