1. Infezione virale in Drosophila
- Infettare le mosche mediante nano-iniezione ed eseguire saggi di sopravvivenza.
- Tirare i capillari per preparare gli aghi per iniezione, riempire nuovamente l'ago per iniezione con olio e montare l'iniettore.
- Anestetizzare le mosche sul pad sotto un leggero flusso di CO2. Inoculare i moscerini mediante iniezione intratoracica di 50,6 nL di soluzione virale (100 PFU, diluito con tampone Tris-HCl, pH 7,2). Iniettare almeno 3 fiale di mosche (20 mosche per fiala).
nota: L'iniezione richiede molto tempo (generalmente 100 mosche all'ora) e la replicazione del virus Drosophila C (DCV) è molto rapida, quindi è molto importante annotare il tempo esatto sulla provetta una volta terminata ogni fiala (20 mosche). L'inserimento di solo buffer viene impostato come controllo fittizio. Di solito, i moscerini adulti maschi sono preferiti, poiché i risultati sono più stabili e riproducibili rispetto a quando si utilizzano le femmine poiché le variazioni ormonali durante l'accoppiamento e la riproduzione possono influenzare la lettura delle femmine.
- Far crescere le mosche iniettate a 25 °C, 60% di umidità in un normale ciclo luce/buio. Rifornisci le mosche con cibo fresco ogni giorno e registra il numero di mosche morte.
- Eseguire almeno 3 repliche biologiche e tracciare la curva di sopravvivenza.
- Per l'analisi statistica dei dati di sopravvivenza, generare curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier mediante software statistico. Eseguire un test di rango logaritmico per calcolare i valori P. Sulla tabella di sopravvivenza, inserisci le informazioni per ogni materia. Il software calcola quindi la percentuale di sopravvivenza in ogni momento e traccia un grafico di sopravvivenza di Kaplan-Meier.
nota: NON aggiungere altro lievito al flaconcino. Rispetto ai controlli simulati, le mosche infette da DCV hanno occasionalmente ascite e sono goffe, il che le rende vulnerabili al lievito appiccicoso. È meglio registrare più punti temporali nell'esperimento preliminare per scoprire un lasso di tempo in cui avverrà la morte di massa per le mosche infette. Generalmente, le mosche infette raramente muoiono entro i primi due giorni, anche per le linee mutanti Dicer-2. Per la mosca w1118 (Bloomington 5905) priva di Wolbachia infettata con 100 PFU di DCV, questa finestra temporale è di circa 3-5 giorni dopo l'infezione. I moscerini della frutta che muoiono entro 0,5 ore dopo l'iniezione non dovrebbero essere conteggiati come decessi perché possono essere uccisi da ferite da ago e non da infezioni virali.
2. Misurazione del carico DCV mediante saggio dell'effetto citopatico (CPE)
- Il giorno 1, infettare i moscerini maschi come descritto nei passaggi 1.1.1-1.1.2. Raggruppa le mosche iniettate in gruppi di 20 e mantienile in crescita con cibo fresco per mosche per il tempo desiderato (in genere per 24 ore o 3 giorni). Fornisci alle mosche cibo fresco ogni giorno.
- Il giorno 2, seminare le cellule di Drosophila S2* in una piastra di coltura cellulare di 10 cm alla densità di circa 5 x106 a 1x107 cellule/mL.
- Il giorno 3, raccogliere 5 mosche (sotto un leggero flusso di CO2) e macinarle in una provetta da centrifuga da 1,5 ml per 30 s con 200 μl di tampone Tris e perle di ceramica utilizzando un omogeneizzatore. Conservare i campioni a -80 °C o procedere immediatamente alla fase successiva.
- Agitare accuratamente il campione. Utilizzare una siringa da 1 ml e un filtro da 0,22 μm per filtrare il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml.
- Eseguire diluizioni seriali di 10 volte del surnatante con terreno completo per cellule S2*. Aggiungere 50 μl di diluizioni nel pozzetto. Aggiungere 50 μL di terreno di coltura senza virus al pozzetto classificato come pozzetto di controllo negativo.
nota: Per ogni tasso di diluizione sono stati utilizzati 8 pozzetti. Poiché la resa tipica di DCV è di circa 10 8-109 PFU/mL, la diluizione dovrebbe coprire almeno ~10-5-10-10.
- Il giorno 4, osservare il CPE con un microscopio a campo chiaro con un obiettivo 20X o 40X. Classificare un pozzetto in cui le cellule appaiono sfocate e il terreno è pieno di frammenti come un "pozzetto positivo" e un pozzetto in cui la morfologia cellulare è normale come un "pozzetto negativo".
- Contrassegnare i pozzetti CPE positivi o negativi rispettivamente con + o –. Calcolare la dose infettiva media di coltura tissutale virale (TCID50).
3. Carico DCV misurato da qRT-PCR
- Il giorno 1, infettare le mosche come descritto sopra. Raggruppare le mosche maschi iniettate (20 mosche/gruppo) e farle crescere su cibo fresco per mosche per il tempo desiderato, in genere per 24 ore o 3 giorni. Fornisci alle mosche cibo fresco ogni giorno.
- Il giorno 3, raccogliere 5 moscerini sotto un leggero flusso di CO2 in una provetta da 1,5 mL con 200 μL di tampone di lisi e 20 perle di ceramica (diametro = 0,5 mm) e macinare i campioni con un omogeneizzatore ad alta velocità per 30 s. Aggiungere 800 μL di tampone di lisi aggiuntivo a ciascuna provetta e conservare i campioni a -80 °C o eseguire immediatamente l'estrazione dell'RNA e la qRT-PCR.
- Preparare puntali, provette prive di RNasi e acqua deionizzata, trattata con dietilpirocarbonato (DEPC) e filtrata con membrana da 0,22 μm. Aggiungere 200 μL di cloroformio (≥99,5%) nel campione e agitare energicamente a mano per 15 s. Incubare per 5 minuti o più a temperatura ambiente fino a quando la fase acquosa e la fase organica sono chiaramente separate.
nota: Il cloroformio è estremamente pericoloso e deve essere maneggiato con cura. NON agitare il campione, che aumenterà il rischio di contaminazione del DNA.
- Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Raccogliere 400 μl di surnatante e trasferire il surnatante in nuove provette. Miscelare con lo stesso volume di isopropanolo (≥ 99,5%), capovolgere delicatamente i campioni 20 volte a mano, quindi precipitare per 10 minuti o più a temperatura ambiente.
nota: Le precipitazioni a -20 °C aumenteranno la resa dell'RNA.
- Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 minuti a 4 °C. I pellet di RNA bianco sono visibili sul fondo della provetta.
- Scartare il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo al 70% (etanolo in acqua DEPC) e capovolgere alcune volte per lavare l'RNA.
- Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e asciugare l'RNA per 5-10 minuti; L'RNA dovrebbe diventare trasparente.
- Aggiungere 50 μl di acqua DEPC al campione, pipettare per alcune volte e agitare.
- Prelevare 3 μL di RNA per titolare la concentrazione di RNA. Quantificare l'RNA a 260 nm. Normalmente, la concentrazione di RNA estratta con questo protocollo è di circa 100-500 μg/μL, che è adatta per la sintesi del cDNA.
- Utilizzare 2 μg di RNA per la sintesi del cDNA. Diluire il campione a 100 μl con ddH2O e conservare a -20 °C.
- Eseguire qRT-PCR secondo le istruzioni del produttore ed eseguire qRT-PCR.
nota: Per la sintesi del cDNA del DCV, i primer casuali hanno funzionato molto meglio dei primer Poly A. L'espressione dell'mRNA del DCV è normalizzata all'mRNA della proteina ribosomiale endogena 49 (rp49). Primer oligonucleotidici utilizzati in questa parte:
rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (avanti) e
5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (rovescio);
DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (avanti) e
5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (rovescio);
vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (avanti) e
5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (inverso);
RNA 1 (vir-1) indotto da virus 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (avanti) e
5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (rovescio).